草甘膦暴露与自闭症谱系障碍（ASD）中的表观遗传-环境相互作用：circTiam1 的作用

《Journal of Hazardous Materials》：Glyphosate Exposure and Epigenetic-Environmental Interactions in ASD: The Role of circTiam1

　　摘要：
草甘膦（Gly）是使用最广泛的农业化学品，流行病学研究表明它与自闭症谱系障碍（ASD）发病率的增加有关，但其机制仍不清楚。为此建立了一种小鼠模型，模拟妊娠和哺乳期间接触草甘膦类除草剂（GBH）（浓度为0.10-1.00%）的情况，以评估其类似ASD的神经发育影响。通过使用神经元和小胶质细胞系（小鼠BV2、人类HMC3）来阐明GBH引起的神经发育缺陷的机制。GBH引发了剂量依赖性的类似ASD的行为，包括刻板重复动作和社交障碍，但没有表现出类似焦虑的改变。这些行为变化伴随着内侧前额叶皮层（mPFC）中的神经元损伤和突触丢失。从机制上讲，GBH选择性上调了小胶质细胞中的CACNA2D3蛋白，而不影响神经元，这提高了小胶质细胞的Ca2?水平，促进了促炎细胞因子的产生，并激活了NF-κB信号通路，同时损害了吞噬功能。高通量环状RNA（circRNA）测序发现circTiam1表达上调，circTiam1通过结合miR-128-3p来抑制CACNA2D3的表达，这一点通过敲低/过表达及结合实验得到了证实。患有ASD的儿童的血清中circTiam1水平升高，并且与儿童自闭症评分量表（Childhood Autism Rating Scale）和社交反应量表（Social Responsiveness Scale）得分呈正相关。这些发现揭示了一个新的circTiam1/miR-128-3p/CACNA2D3轴，该轴可能介导小胶质细胞功能障碍，从而在GBH暴露后导致类似ASD的行为，强调了表观遗传学与环境之间的关键相互作用。未来需要利用体内模型、针对小胶质细胞的模型以及独立的临床队列来进一步研究circTiam1的机制、生物标志物及其转化医学意义。

引言：
自闭症谱系障碍（ASD）是一种复杂的神经发育障碍，其特征是社交沟通能力受损以及存在受限的重复性行为[1]。这些症状通常在儿童早期显现，并常常导致显著的终身功能损害[2]。根据2025年的流行病学数据，2022年美国ASD的患病率估计为每31名儿童中有1名[3]。近年来，ASD的患病率有所上升，但其潜在的发病机制仍不清楚。ASD的病因被认为是多因素的，涉及遗传易感性和环境因素之间的复杂相互作用[4]。已确定了几种环境风险因素，包括妊娠期肥胖、父母药物滥用以及接触环境中的有毒物质[5][6]。其中，孕期和生命早期接触杀虫剂被认为是ASD的重要风险因素[7]。基于草甘膦的除草剂（GBH）是全球使用最广泛的除草剂，其主要成分是草甘膦（Gly）[8]。草甘膦抑制了莽草酸途径中的5-烯醇丙酮醛 shikimate-3-磷酸合酶（EPSPS）[9]。由于哺乳动物体内缺乏莽草酸途径，最初认为GBH对人类的毒性较低，且仅对杂草具有选择性作用[10]。值得注意的是，GBH是广泛存在的环境污染物，在人类的尿液、血液和母乳中都有发现[11]。有趣的是，在过去二十年里，随着耐GBH作物的广泛采用以及自2000年左右以来GBH使用量的增加，美国ASD的患病率显著上升[12]。美国加利福尼亚州进行的一项基于人群的病例对照研究发现，产前接触GBH与ASD风险增加有关[13]。尽管这些流行病学观察结果表明可能存在关联，但GBH暴露导致ASD发病的分子机制仍不明确。

小胶质细胞是大脑中的常驻免疫细胞，越来越多地被认为在ASD的病理生理学中起关键作用，主要是因为它们在介导神经免疫反应中的作用[14]。在ASD患者的脑脊液和死后脑组织中反复检测到高水平的促炎细胞因子，包括IL-1β、TNF-α和IL-6[15][16]。环状RNA（circRNA）是一类非编码RNA分子，其特点是具有共价闭合的结构，通过前体mRNA的反剪接形成。circRNA的环状结构使其具有天然的抗RNase酶能力，从而能够在免疫系统中发挥重要的持续调节作用[17]。circRNA通过多种机制调节免疫反应，包括作为microRNA（miRNA）的“海绵”作用、结合基因以及作为蛋白质合成的模板[18]。此外，circRNA在组织中表达具有特异性，在哺乳动物大脑中含量丰富，在神经系统发育中发挥关键作用。新兴证据表明circRNA的表达水平与ASD的发展密切相关。在ASD患者的脑组织中鉴定出许多差异表达的circRNA[19]。此外，围产期接触GBH已被证明会导致后代小鼠的海马体和前额叶皮层（PFC）中circRNA表达异常，从而导致神经毒性[20][21]。然而，circRNA在调节GBH诱导的ASD行为中扮演的具体角色和机制仍有待探索。

小胶质细胞中Ca2?信号通路的功能失调会促进促炎介质的产生和释放，从而导致神经炎症[22]。与ASD风险增加相关的CACNA2D3基因编码电压门控钙通道（Cav）的辅助亚基，这些通道是细胞内钙流入的关键调节因子[23]。值得注意的是，病例对照研究显示ASD患者的脑皮质中Ca2?水平显著升高，强调了钙稳态失衡在ASD发病中的关键作用[24]。接触GBH会加剧神经系统中的钙调节紊乱。研究表明，GBH暴露会通过改变神经元和胶质细胞中的Ca2?信号通路而导致神经毒性，进而影响突触功能和神经发育[25]。然而，GBH诱导的ASD行为中小胶质细胞中钙稳态紊乱的机制仍不完全清楚。因此，为了研究circRNA在GBH诱导的ASD行为中的作用，我们建立了一种妊娠和哺乳期间接触GBH的小鼠模型，并通过高通量circRNA测序来分析可能与这些行为相关的差异表达circRNA。通过结合生物信息学分析和体内验证实验的方法，筛选并确定了与GBH诱导的ASD行为相关的关键circRNA。进一步利用人和小鼠来源的小胶质细胞在体外研究Gly暴露对小胶质细胞功能的影响及机制途径。通过靶向敲低或过表达circRNA的小胶质细胞模型来验证潜在的内源RNA（ceRNA）在Gly诱导的小胶质细胞功能障碍中的作用。本研究为化学暴露引起的神经行为异常发生过程中的基因改变和表观遗传调控之间的相互作用提供了新的见解，为进一步探讨ASD的环境病因提供了科学依据。

研究人群和生物样本收集：
本研究从上海交通大学医学院贵州分院的ASD儿童中招募了病例组。对照组则来自中国贵州贵阳白云区人民医院的神经发育正常的儿童。由神经发育障碍领域的专家对儿童进行了儿童自闭症评分量表（CARS）和第二版社交反应量表（SRS-2）的评估和填写。

结论：
本研究揭示了妊娠和哺乳期间接触GBH会在小鼠后代中引发类似ASD的行为和前额叶皮层突触丢失，可能涉及小胶质细胞功能障碍。circTiam1似乎作为一种新的ceRNA，通过结合miR-128-3p来上调CACNA2D3，从而破坏钙稳态，激活NF-κB，促进神经炎症和吞噬功能受损。ASD患儿血清中circTiam1水平升高与症状严重程度相关，这表明它在ASD中的潜在作用。

环境影响：
本研究确定了circTiam1/miR-128-3p/CACNA2D3轴与体外小胶质细胞功能障碍有关，并支持其在妊娠和哺乳期间接触GBH后导致类似ASD的行为和神经发育改变中的可能贡献。它确认circTiam1是一种新的、稳定的表观遗传调控因子，与环境暴露和临床症状严重程度相关。这些发现突显了在关键时期广泛接触GBH的潜在神经发育危害。

伦理批准和参与同意：
在参与研究之前，所有受试者或其授权代表均签署了书面知情同意书。研究中的样本和数据得到了贵州医科大学伦理委员会的批准（编号247/2024）。所有动物实验均得到了贵州医科大学机构动物护理和使用委员会的批准（编号2303082）。

出版同意：
所有作者同意提交本手稿。

利益冲突：
作者声明没有潜在的利益冲突。

资金支持：
本研究得到了国家自然科学基金（项目编号82304096、82260630和82660742）和贵州医科大学优秀青年人才计划（项目编号2023/108）的支持。

作者贡献：
周顺：撰写-原始草稿、数据可视化、方法学设计、实验实施、概念构建。
周浩：撰写-审阅与编辑、项目监督、资金筹集。
尤明丹：撰写-原始草稿、数据可视化、项目监督、资金筹集、概念构建。
杨广宏：项目监督。
冉金凤：数据可视化、实验实施。
吴巧月：方法学设计。
何秀：撰写-审阅与编辑、数据可视化、利益冲突声明。

作者声明：
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的研究工作。