外源环二鸟苷酸促进藻菌共生系统在长期环丙沙星胁迫下的多层次功能恢复

《Journal of Hazardous Materials》：Exogenous cyclic di-GMP promotes multilevel functional restoration of algal-bacterial symbiotic system under prolonged ciprofloxacin stress

　　

摘要

高浓度抗生素对藻菌相互作用产生显著压力，从而威胁生物废水处理系统的功能稳定性。然而，恢复此类受损系统功能的有效且可扩展的策略仍不完善。在本研究中，将藻菌共生系统（ABSS）置于50  mg/L环丙沙星（CIP）持续胁迫下，随后外源补充100  μg/L环二鸟苷酸（c-di-GMP）。暴露于高浓度CIP后，胞内c-di-GMP和自诱导因子-2（AI-2）水平显著降低，同时胞外聚合物（EPS）产生、吲哚-3-乙酸（IAA）合成、微藻光合效率、无机碳同化和整体污染物去除性能均减少。外源补充c-di-GMP后，藻菌共生体胞内c-di-GMP和AI-2水平分别增加156.8%和137.4%，同时EPS、IAA、叶绿素a（Chl a）含量、PSII最大量子产量（F_v/F_m）、碳酸酐酶活性和无机碳同化作用得以恢复。分段回归分析显示，17个功能指标中有16个相对于非c-di-GMP处理对照组呈现显著正斜率差异，表明微生物信号传导、胞外基质调控和系统级性能实现了协同功能恢复。宏转录组分析进一步揭示，ABSS表现出转录上不同的群落状态。转录响应具有功能选择性，在生物膜形成、EPS生物合成、光合作用和碳固定方面呈正向响应，而非群体感应（QS）的全局增强。这些发现表明，外源c-di-GMP补充赋予了ABSS界面通讯和代谢功能的协同恢复，从而为提高系统在高浓度抗生素胁迫下的韧性提供了有前景的干预策略。

引言

环丙沙星（CIP）是一种广泛开具的氟喹诺酮类抗生素，常在工业废水、地表水和地下水中检测到。由于其化学稳定性高且难以被微生物降解，CIP在常规污水处理后仍存在。尽管受纳水体中报告的CIP浓度通常为ng/L至μg/L水平，但在制药制造废水和其他源主导的高强度废水中可能出现更高浓度[1]、[2]。一些研究报告指出，此类废水流中CIP浓度高达50  mg/L[3]、[4]。暴露于如此高浓度的CIP可能会抑制关键功能微生物、干扰细胞代谢并损害生物处理系统的运行稳定性[5]。

藻菌共生系统（ABSSs）因其能够同时介导污染物去除、资源回收和无机碳固定，受到广泛关注[6]。其对含抗生素废水的应用也已通过实验评估[7]、[8]。藻酸盐固定化可显著改善沉降和生物量回收[9]。固定化颗粒提供空间结构化的微环境，使能够高分辨率地研究抗生素暴露下藻菌共体的生理和分子响应[8]。然而，藻菌共生体的性能不仅取决于光能自养菌和异养菌的共存，还涉及底物交换、化学信号传导和细胞附着或生物絮凝的种间协调[6]。高抗生素浓度会抑制藻类生长、诱导氧化应激、损害光合生理并降低营养去除性能[7]。因此，在持续抗生素暴露下性能的恶化可能不仅源于对个体种群的直接毒性，也源于这些合作功能的侵蚀。

群体感应（QS）使微生物能够合成、释放和检测自诱导因子，并在信号浓度超过阈值时协调群体水平的基因表达。在ABSSs中，QS相关信号传导，包括酰基高丝氨酸内酯（AHLs）和自诱导因子-2（AI-2），与种间相互作用、细胞聚集、胞外聚合物（EPS）产生和污染物转化相关[10]。例如，AHL介导的QS可以调控参与EPS生物合成的基因，并影响胞外基质组装所需的胞内能量供应[11]。相比之下，环二鸟苷酸（c-di-GMP）是一种近乎普遍的细菌第二信使，由GGDEF结构域二鸟苷酸环化酶（DGCs）合成，由EAL/HD-GYP结构域磷酸二酯酶（PDEs）降解[12]。其胞内浓度控制从运动态到固着态的转变，并直接调控EPS产生、生物膜形成和聚集结构的维持[13]。这些研究表明，QS相关通讯和c-di-GMP调节都与微生物聚集和胞外基质功能密切相关，为它们在维持藻菌系统界面稳定性中的作用提供了理论基础。

然而，大多数现有研究集中在内源性c-di-GMP代谢上——包括合成、降解和胞内信号转导——通过遗传调控DGCs、PDEs或c-di-GMP结合受体实现，而外源补充c-di-GMP到运行生物反应器中仍研究不足[12]。新兴证据表明，外源c-di-GMP可以影响生物膜和基质相关功能，而不一定需要已证实的胞内摄取途径。例如，据报道胞外c-di-GMP可调节弯杆菌的菌膜形成和分散[14]。外源c-di-GMP也与工程微生物聚集体的功能改善相关。在储存的好氧颗粒污泥中，共同补充80 nmol/L c-di-GMP和AHLs增强了代谢活性并促进了富含蛋白质的胞外基质恢复[15]。同样，c-di-GMP与可扩散信号因子（DSF）信号传导之间的串扰与低温条件下颗粒稳定性改善相关[16]。然而，这些研究大多局限于单物种生物膜或异养颗粒污泥。因此，尚不清楚外源c-di-GMP是否在ABSSs中引发类似响应，以及这些响应是否伴随着界面、光合和碳同化功能的协同恢复。

在本研究中，模拟ABSS在分步CIP暴露制度下运行72天，以表征持续高浓度CIP胁迫导致的功能去稳定和随后通过外源c-di-GMP补充介导的恢复。通过整合多种互补指标全面评估系统响应：污染物去除效率、颗粒结构完整性、光合和抗氧化生理参数、胞内c-di-GMP和AI-2浓度、EPS组成和IAA水平以及宏转录组图谱。在所有评估水平上量化恢复轨迹，以确定功能恢复的程度和层次。本研究旨在表征伴随外源c-di-GMP补充后从抗生素诱导抑制到功能恢复转变的多层次生理、结构和功能响应，从而为增强藻菌共生系统在持续高浓度抗生素胁迫下的韧性建立机制基础。

章节摘要

固定化藻菌共生颗粒的制备

基于初步筛选其污染物去除性能（图S1），选用发菜（Oscillatoria tenuis, FACHB-1052）和平滑芽孢杆菌（Bacillus licheniformis, Bio-67637）制备固定化藻菌共生颗粒。发菜在BG-11培养基中无菌培养，温度25 °C，光照/黑暗周期12  h/12  h，光照强度3000  lx。平滑芽孢杆菌在营养肉汤中30 °C、150  rpm振荡培养。两者均培养至

污染物去除性能

ABSS的污染物去除性能表现出对环丙沙星暴露的明显阶段依赖性响应（图1a）。为考虑非生物去除，R1和R2的去除效率分别通过减去R0和R0'的相应平均去除效率进行校正（图S4和S5）。因此，下文报告的所有R1和R2值均代表非生物对照校正后的去除效率。在第一阶段（25  mg/L CIP），两组均保持高处理

结论

持续高浓度CIP胁迫损害了ABSS在多个层级上的QS介导信号传导、EPS相关功能完整性、核心生理过程和整体处理性能。外源c-di-GMP补充与CIP抑制的藻菌共生系统的功能恢复存在因果关系，多层次分析揭示信号通路、胞外基质功能、核心

CRediT作者贡献声明

刘晓梅：可视化。王凡：软件、方法论。陈佳琪：方法论、资金获取。张越：软件。李新杰：验证、项目管理、数据整理。

利益冲突声明

作者声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系，这些关系可能影响本文所述工作。

李新杰|陈佳琪|张越|刘晓梅|王凡

杭州师范大学工程学院，浙江杭州 311121，中国