核磁共振弛豫色散揭示蛋白酪氨酸磷酸酶1B中酸性环的运动幅度相差一个数量级

《Journal of Magnetic Resonance》：NMR relaxation dispersion reveals an order of magnitude range of acid loop motions in protein tyrosine phosphatase 1B

　　

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  ¹⁹F CPMG和R_1ρ测量了63 μs的动力学过程。
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  不同的NMR核在蛋白质运动中显示出数量级的差异

引言

蛋白质酪氨酸磷酸酶（PTPs）是重要的信号传导酶，与蛋白质酪氨酸激酶协同作用以调节许多生化途径。[1] PTPs在生长因子信号传导、激素信号传导、免疫反应、胰岛素信号传导以及几种其他生理相关途径中发挥作用。此外，PTP酶在生命的每一个领域都具有广泛的关联性——真核生物、原核生物和古菌。尽管PTPs的功能和来源多种多样，但它们的活性位点和两步催化机制高度保守（图1B）。[2] PTP催化位点由几个环装饰，包括P环、acid环、Q环、pTyr环和E环（图1A），其构象动力学对催化和底物结合至关重要。[3]，[4]^，[5]，[6]，[7] 底物结合到活性位点后，严格保守的位于P环中的半胱氨酸硫醇盐（含有共识序列(I/V)-HCXAGXGR(S/T)）对底物磷原子进行亲核攻击。在PO键断裂的同时，包含保守催化酸的相邻acid环围绕活性位点关闭，使得该酸能够质子化离去的苯基。去磷酸化的肽现在可以解离，留下一个共价硫磷酸酶中间体。在反应的第二步中，该中间体通过酸和位于Q环上的保守谷氨酰胺的共同作用而水解。尽管催化机制保守，[8]，[9]过渡态相同，[4]，[10]，[11]且活性位点结构相同，但迄今为止研究的PTP酶的催化速率至少相差两个数量级[12]。关键的催化酸位于柔性环上，这表明催化速率的差异部分源于acid环动力学的差异。一个表现出acid环动力学与催化速率常数之间强相关性的PTP是人体酶，即蛋白质酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B，UniProtKB：P18031）[5]。

PTP1B调节几个重要的代谢途径，如果这些途径没有得到适当的控制，会导致II型糖尿病、肥胖症、癌症和免疫系统受损等疾病。[13] 许多研究致力于设计通过稳定acid环的非活性（开放）构象来调节PTP1B活性的抑制剂；然而，没有任何一种药物进入临床试验之外的阶段[14]，[15]，[16]。鉴于环关闭的时间尺度影响动力学转换速率，进而影响代谢途径的调节，加深对acid环运动机制的理解对于了解这些具有生物医学重要性的酶的功能至关重要。

溶液NMR弛豫色散实验已被用于研究PTP1B的acid环以及其他PTPs[4]，[5]，[11]，[17]，[18]，[19]，[20]，[21]，[22]。NMR研究提供了有关蛋白质动力学的信息，其具有原子分辨率且标记的干扰最小。此外，许多NMR实验可用于研究发生在皮秒至秒（ps-s）时间尺度内的动力学过程。原子分辨率和数个数量级的实验可访问时间尺度的结合，使NMR非常适合对蛋白质动力学进行详细研究。PTP1B的NMR研究使得能够对acid环残基的酰胺主链和甲基侧链进行动力学表征[5]，[17]，[19]，[20]。结合计算技术，这些研究表明acid环运动的简单图景比严格的双位点过程更复杂。[4]，[12]，[17]，[19]，[20]，[23]，[24] 在这里，我们使用¹⁹F色氨酸CPMG和R_1ρ实验，以及¹³CH₃甲基和¹⁵N酰胺/吲哚弛豫色散（图1C）来探索acid环运动，以扩展此项先前的工作。

章节片段

定点突变

W179F的定点突变是使用QuikChange定点突变试剂盒完成的，并在耶鲁大学科克雷克DNA测序核心实验室通过DNA测序进行确认。

蛋白质表达与纯化

含有野生型和突变型PTP1B基因的质粒被转化到BL21(DE3)感受态细胞中，并在37 °C下于5 mL LB培养基中过夜培养。然后，将LB起始培养物在室温下离心10分钟，沉淀重悬于100 mL H₂O M9最小培养基中，并在37 °C下培养。

生物化学和结构表征

通常假设，spin-1/2同位素标记对蛋白质的结构和动力学影响很小，很少例外。然而，氟和氢在化学性质上存在显著差异，因此用¹⁹F替代¹H需要额外考虑。长期以来已知，氟化底物比其自然质子化对应物反应更不易，此外在某些情况下，将¹⁹F标记的氨基酸掺入。

CRediT作者贡献声明

Ryan M. Anderson：撰写 – 审阅与编辑，撰写 – 原稿，验证，调查，形式化分析。J. Patrick Loria：撰写 – 审阅与编辑，撰写 – 原稿，监督，方法学，调查，资金获取，形式化分析，概念化。

利益冲突声明

作者声明了以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：Patrick Loria报告获得了美国国家卫生研究院的资金支持。Ryan Anderson报告获得了美国国家卫生研究院的资金支持。Ryan Anderson报告获得了美国国家科学基金会的资金支持。如果有其他作者，他们声明没有已知的竞争性财务利益或

致谢

我们感谢Jinchan Liu博士提供输入文件并进行了有关WTM-eABF模拟的有益讨论。我们也感谢Xiaoyuan Wang博士提供甲基V184 CPMG数据。资助来自NIH R01 GM112781给JPL。RA承认该研究得到了美国国家综合医学科学研究所美国国家卫生研究院生物物理培训经费（T32GM149438）的支持。内容完全由作者负责，不一定代表

Ryan M. Anderson|J. Patrick Loria