《Clinical and Translational Medicine》：Single-cell transcriptomic analysis reveals subtle fluctuations of oocyte cryopreservation on mouse early embryo development
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背景：卵母细胞冷冻保存广泛应用于辅助生殖技术，但其对胚胎发育的影响仍受关注。本研究旨在确定卵母细胞冷冻保存是否在早期卵裂期和囊胚期诱导转录改变。
方法：研究人员对来自冷冻保存（cryo）和新鲜（fresh）卵母细胞的小鼠中期II（Metaphase II，MI
背景：卵母细胞冷冻保存广泛应用于辅助生殖技术，但其对胚胎发育的影响仍受关注。本研究旨在确定卵母细胞冷冻保存是否在早期卵裂期和囊胚期诱导转录改变。
方法：研究人员对来自冷冻保存（cryo）和新鲜（fresh）卵母细胞的小鼠中期II（Metaphase II，MII）卵母细胞以及早/晚期1细胞、早/晚期2细胞、桑椹胚和囊胚阶段的胚胎进行单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）。比较两组间的转录组图谱。
结果：冷冻组与新鲜组囊胚的整体转录组高度相似。卵母细胞冷冻保存未改变性别比例或着床前发育进程。在囊胚中，冷冻保存仅影响少数个别基因。在雌性和雄性囊胚中，尽管卵母细胞冷冻保存增加了低Xist表达细胞的比例，但并未破坏X连锁基因剂量。在囊胚内细胞团（inner cell mass，ICM）中，发现X连锁基因表达与细胞周期进程之间存在负相关，且这种负相关在滋养外胚层（trophectoderm，TE）细胞中更为显著。总体而言，这种阶段依赖性的协调性未受冷冻保存干扰。CellChat分析显示，ICM与TE之间的信号相互作用强度在冷冻组中也未见显著变化。
结论：卵母细胞冷冻保存不会严重破坏胚胎的整体转录完整性、发育潜能和X染色体剂量补偿，但可能引起微妙的分子变化。这些发现强调需要持续改进冷冻保存方法，并进一步调查辅助生殖技术程序的亚急性安全性。
研究背景与现存问题
卵母细胞冷冻保存为不孕症患者及其他情况下的女性提供了通过储存卵母细胞以备将来使用的生育力保存机会。此外，冷冻卵母细胞还可用于与疾病相关的选择性生育力保存。玻璃化冷冻作为一种比慢速冷冻更先进的生育力保存策略，已在临床应用多年。随着来自玻璃化冷冻卵母细胞的婴儿出生数量增加，该方法对后代的安全性引发了讨论。已有研究表明，玻璃化冷冻卵母细胞在受精、胚胎发育和植入潜力等方面功能上与新鲜卵母细胞相当。临床结局和后代安全性的研究也表明，使用冷冻卵母细胞未增加不良产科和围产期结局的风险。然而，由于温度变化、渗透压应激、冷冻保护剂毒性和/或相变等因素，冷冻保存过程对胚胎发育潜能的负面影响尚不明确。近期研究揭示，卵母细胞冷冻保存可能导致生理和转录组变化。虽然囊胚形成率和染色体非整倍体率在新鲜和冷冻卵母细胞间相当，但冷冻保存可能破坏表观遗传机制，从而改变胚胎基因表达，导致胎盘或胎儿阶段的发育异常，并增加成年后的疾病易感性。在动物中，卵母细胞冷冻保存后的囊胚可能表现出甲基化谱降低。通过测序技术，研究发现玻璃化或慢速冷冻卵母细胞存在转录组变化，包括与胚胎发育、能量代谢、DNA完整性和细胞周期相关基因的下调，且这种变化在慢速冷冻卵母细胞中更为显著。以往研究多局限于冷冻卵母细胞本身，而对源自冷冻卵母细胞的囊胚全局转录组的影响尚不清楚。由于技术限制，既往研究只能检测整个囊胚的基因表达。然而，单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术能够根据谱系特异性基因的表达区分内细胞团（ICM）和滋养外胚层（TE）这两种细胞类型，从而更好地探究卵母细胞冷冻保存对胚胎发育的影响。因此，本研究利用scRNA-seq探索了小鼠卵母细胞冷冻保存对TE和ICM细胞，以及卵母细胞、早/晚期1细胞胚胎和早/晚期2细胞胚胎的全局转录效应。
关键技术方法
研究人员采用单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术，对来自冷冻保存和新鲜卵母细胞的小鼠中期II（MII）卵母细胞、早/晚期1细胞、早/晚期2细胞、桑椹胚和囊胚阶段的胚胎进行转录组分析。样本来源于C57BL/6J雌鼠和129/SvEvBrd雄鼠。通过免疫荧光染色对囊胚进行形态学验证，并使用CellChat包进行细胞间通讯分析。此外，还应用了CytoTRACE和Monocle包进行分化潜能和伪时间分析。
研究结果
3.1 早期胚胎细胞聚类与基因表达
通过无监督聚类分析，研究人员将囊胚细胞分为ICM和TE两个亚群，分别高表达各自谱系标志基因。冷冻组与新鲜组在各发育阶段的细胞数量无显著差异。免疫荧光染色证实两组囊胚均具有清晰的ICM和TE结构分离。差异表达基因（DEG）分析显示，从MII卵母细胞到晚2细胞阶段，冷冻组与新鲜组之间几乎无DEG。仅在早期2细胞中发现1个DEG，在ICM中发现5个DEG，在TE中发现9个DEG，表明冷冻保存仅影响少量基因。
3.2 卵母细胞冷冻保存与胚胎性别判定
通过分析X和Y连锁基因表达水平，共鉴定出24个雌性胚胎和19个雄性胚胎，性别比例大致平衡。两组间的性别比例无统计学显著差异。
3.3 早期胚胎的发育动力学与性别特异性Xist调控
伪时间轨迹分析显示，两组胚胎从MII卵母细胞到囊胚的发育轨迹高度一致。X连锁基因表达比例分析表明，冷冻保存未显著改变雌性和雄性囊胚细胞中X连锁基因的整体表达水平，维持了正常的X染色体表达剂量。尽管冷冻组中Xist表达略低，但关键X染色体失活（XCI）调控基因Atrx和Spen的表达未受影响。冷冻组中低Xist表达细胞的比例在雌性TE和ICM中显著增加，在雄性ICM中也显著增加。CytoTRACE分析显示，两组的发育潜能无显著差异。
3.4 卵母细胞冷冻保存对不同囊胚细胞类型细胞周期调控的影响
细胞周期分析显示，冷冻组与新鲜组在TE和ICM各细胞周期时相（G1、S、G2/M）的比例无显著变化。关键细胞周期调控基因的表达模式在两组间相似。进一步分析表明，冷冻保存未显著改变雌性或雄性囊胚中高Xist表达细胞在不同细胞周期时相的分布比例。
3.5 着床前发育过程中X连锁基因表达与细胞周期动态的相关性
研究人员计算了X染色体和细胞周期的模块评分。结果显示，在囊胚阶段，冷冻组与新鲜组的细胞周期评分和X染色体模块评分均无显著差异。Pearson相关性分析发现，在TE和ICM中，细胞周期与X连锁基因表达之间存在阶段特异性的弱负相关，且在TE中具有统计学显著性。冷冻保存未扰乱这种相关性。
3.6 卵母细胞冷冻保存对囊胚阶段ICM与TE细胞间相互作用的影响
CellChat分析显示，冷冻保存未导致囊胚内细胞间通讯的数量或强度发生明显改变。尽管冷冻组中BMP和WNT信号通路活性升高，而胰岛素样生长因子（IGF）信号通路活性降低，但整体通讯网络的稳健性得以维持。配体-受体对分析揭示了这些通路变化的分子基础，关键基因的表达模式与观察到的相互作用概率变化相一致。
讨论与结论
本研究表明，卵母细胞冷冻保存对小鼠早期卵裂阶段的转录组影响极小，仅在囊胚的ICM和TE中鉴定出少量DEG，凸显了胚胎程序的恢复力。全局发育轨迹和ICM分化潜能的严格保守性证明囊胚的核心发育程序保持完整。尽管Xist表达下调，但X连锁基因的整体表达剂量未受影响，表明X染色体剂量补偿机制基本稳定。细胞周期分布和X染色体模块评分的恒定性表明冷冻卵母细胞在受精后维持了生理性的细胞分裂节律和剂量补偿平衡。细胞间通讯分析显示，尽管某些信号通路存在微小变化，但通讯网络整体稳健性足以支持囊胚的功能完整性。研究结论指出：卵母细胞冷冻保存不会严重破坏胚胎的整体转录完整性、发育潜能和X染色体剂量补偿，但可能引起微妙的分子变化。这些发现强调需要持续改进冷冻保存方法，并进一步调查辅助生殖技术程序的亚急性安全性。
