《Immunity, Inflammation and Disease》：Juanbi Tang Attenuates Intervertebral Disc Degeneration by Suppressing p38MAPK/NF-κB Signaling and Activating Atg5-Dependent Autophagy to Promote Macrophage M2 Polarization: In Vivo and In Vitro Evidence
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**背景**：椎间盘退变（intervertebral disc degeneration, IDD）由巨噬细胞介导的炎症驱动，涉及p38MAPK/NF-κB信号通路和自噬流受损。蠲痹汤（Juanbi Tang, JBT）是一种经典十一味中药复方，自公元173
**背景**：椎间盘退变（intervertebral disc degeneration, IDD）由巨噬细胞介导的炎症驱动，涉及p38MAPK/NF-κB信号通路和自噬流受损。蠲痹汤（Juanbi Tang, JBT）是一种经典十一味中药复方，自公元1732年即有治疗痹证（一种涵盖退行性脊柱疾病表现的传统诊断）的记载，临床显示出抗炎活性；然而，其在IDD中的分子机制尚未明确。
**方法**：采用高效液相色谱（high-performance liquid chromatography, HPLC）指纹图谱对JBT化学成分进行表征，以蛇床子素（osthole）为定量参照标准（批次间相对标准偏差[relative standard deviation, RSD]为2.3%），依据2020年版《中国药典》，并通过余弦夹角法和相关系数法进行多组分指纹图谱相似度分析，将质控扩展至单一标志物成分之外。建立雄性Sprague–Dawley大鼠环形穿刺IDD模型（五组：假手术组、IDD组、IDD+JBT组、IDD+3-甲基腺嘌呤[3-methyladenine, 3-MA]组、IDD+JBT+3-MA组），通过磁共振成像（magnetic resonance imaging, MRI）、计算机断层扫描（computed tomography, CT）、番红O-固绿（Safranin O–Fast Green）、马松三色（Masson trichrome）及苏木精-伊红（hematoxylin and eosin, HE）染色进行评估。使用脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）刺激（1 μg/mL）的大鼠原代髓核（nucleus pulposus, NP）细胞和小鼠RAW264.7巨噬细胞——包括Atg5过表达（Atg5 overexpression, Atg5-OE）和敲低（Atg5 knockdown, Atg5-KD）变异体——进行体外机制研究。检测终点包括细胞凋亡、线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential, ΔΨm）、活性氧（reactive oxygen species, ROS）、巨噬细胞M1/M2极化、酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）细胞因子定量和蛋白质印迹（Western blot）通路分析。
**结果**：在体内实验中，JBT显著改善Pfirrmann分级、椎间隙高度指数（disc height index, DHI）、番红O染色强度、马松染色胶原含量和Thompson分级，同时抑制血清肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）并恢复白细胞介素-10（interleukin-10, IL-10）；上述获益均被3-MA联合给药部分抵消。JBT抑制p-p38MAPK和p-NF-κB p65，并恢复椎间盘组织中II型胶原（type II collagen, COL II）/基质金属蛋白酶-13（matrix metalloproteinase-13, MMP-13）的平衡。在NP细胞中，JBT将总凋亡率从29.1%降至14.5%，恢复ΔΨm，减轻ROS蓄积，逆转Bax/Bcl-2比值，并激活自噬（LC3-II↑，p62↓）。在RAW264.7巨噬细胞中，JBT在LPS刺激下促进M2极化（CD206+：从28.1%升至49.7%）并抑制M1极化（CD197+：从52.4%降至18.9%），同时伴随自噬激活。跨越正常、Atg5-OE和Atg5-KD巨噬细胞的Western blot分析表明，Atg5表达水平双向调节p62清除及随之而来的NF-κB抑制，与自噬–p62–NF-κB调节模块参与JBT药理活性相一致。
**结论**：JBT通过协同抑制巨噬细胞驱动的炎症和激活自噬减轻IDD，为其在肌肉骨骼疾病中的临床应用提供了机制支持。
**蠲痹汤治疗椎间盘退变的机制研究解读**
**一、研究背景与科学问题**
椎间盘退变（intervertebral disc degeneration, IDD）是全球范围内慢性腰背痛和残疾的主要病因。退变椎间盘的病理特征包括髓核（nucleus pulposus, NP）细胞进行性凋亡、细胞外基质（extracellular matrix, ECM）降解、纤维环破坏以及自我延续的促炎微环境的确立。当前的治疗策略——镇痛药物、康复训练和手术——主要缓解症状负担，并不能改变疾病进展。因此，探索能够修饰疾病进程的治疗手段成为研究热点。
巨噬细胞极化已被确立为决定IDD进展方向的核心因素。M1型巨噬细胞以CD197表面表达为标志，分泌TNF-α、IL-1β和MMP-13，驱动NP细胞凋亡和ECM分解代谢；M2型巨噬细胞以CD206表达为特征，产生IL-10和TGF-β，促进组织稳态和NP细胞存活。药理学上促进M1向M2转化代表了一种机制合理的IDD治疗策略。
p38MAPK/NF-κB信号通路是椎间盘微环境中多种炎症刺激的汇聚节点。机械应力、损伤相关分子模式和促炎细胞因子激活p38MAPK，后者磷酸化NF-κB p65并驱动MMP-13、TNF-α和IL-1β的转录。自噬——由Atg5依赖性自噬体形成介导——近期被确认为通过选择性降解p62/SQSTM1（一种维持NF-κB持续激活的支架蛋白）来调节巨噬细胞极化的关键机制。自噬性p62清除因此构成一个整合NF-κB抑制并降低M1极化阈值的调节模块。
传统中医药（traditional Chinese medicine, TCM）为IDD的复杂免疫病理提供了丰富的多靶点药物来源。蠲痹汤（Juanbi Tang, JBT）是清代程国彭于1732年记载于《医学心悟》的经典方剂，用于治疗痹证。JBT包含十一味中药，按君臣佐使配伍原则组成，在退行性脊柱和关节疾病中有持续临床应用。既往HPLC-Q-TOF分析已鉴定出JBT中44种化学成分，但该复方在IDD中的分子机制此前未被阐明。本研究旨在系统阐明JBT治疗IDD的疗效和机制基础。
**二、主要技术方法**
研究采用了多层面的技术体系。首先，通过HPLC指纹图谱对JBT进行化学表征，以蛇床子素为定量参照标准（批次间RSD为2.3%），并采用余弦夹角法和相关系数法进行多组分指纹图谱相似度分析。在体内层面，建立雄性Sprague–Dawley大鼠尾椎环形穿刺IDD模型（五组：Sham、IDD、IDD+JBT、IDD+3-MA、IDD+JBT+3-MA），通过MRI、CT、番红O-固绿、Masson三色和HE染色五种互补模态评估椎间盘完整性。在体外层面，使用LPS刺激的大鼠原代NP细胞和小鼠RAW264.7巨噬细胞（包括Atg5过表达和敲低变异体），运用流式细胞术、Western blot、免疫荧光、RT-qPCR和ELISA等检测细胞凋亡、线粒体膜电位、ROS、巨噬细胞极化及信号通路变化。
**三、研究结果**
**3.1 HPLC指纹图谱确证JBT化学成分的可重现性**
以蛇床子素为定量参照标准构建线性标准曲线（20–160 μg/mL，R2>0.999），三个独立批次间蛇床子素峰面积RSD为2.3%，远低于5%的接受标准。多组分指纹图谱相似度分析在8–43分钟窗口内解析出16个共有峰，煎剂与浓缩液指纹图谱相似度达0.9994（余弦夹角法）和0.9989（相关系数法），16个共有峰相对峰面积RSD均低于3.3%（均值0.86%），确证浓缩步骤未改变多组分化学特征，制备工艺具有良好的批间重现性。
**3.2 JBT在五种互补评估维度上体内保护椎间盘完整性**
MRI T2加权成像显示JBT显著降低Pfirrmann分级（Sham 1.4 vs IDD 3.8 vs IDD+JBT 2.6）；CT计算DHI显示JBT显著保留椎间隙高度（Sham 1.0 vs IDD 0.6 vs IDD+JBT 0.9）。HE染色和Thompson分级确认JBT减轻NP细胞空泡化、核固缩和细胞分布稀疏等退变特征（Sham 1.2 vs IDD 3.8 vs IDD+JBT 2.4）。番红O-固绿染色显示JBT显著保留蛋白聚糖含量（MOD：Sham 0.8 vs IDD 0.2 vs IDD+JBT 0.6）。Masson三色染色显示JBT显著保留胶原含量和纤维组织（阳性面积：Sham 67.3% vs IDD 21.5% vs IDD+JBT 56.8%）。3-MA联合给药在所有五种评估维度上均部分逆转JBT的获益，表明JBT的结构保护活性具有自噬依赖性。
**3.3 JBT抑制p38MAPK/NF-κB通路并协调体内局部与系统性抗炎反应**
Western blot分析显示，IDD动物椎间盘组织中p-p38MAPK和p-NF-κB p65选择性升高；JBT显著降低二者水平。COL II在IDD组织中显著耗竭（COL II/GAPDH：Sham 1.0 vs IDD 0.3），JBT显著恢复至0.8；MMP-13在IDD组织中显著升高（MMP-13/GAPDH：Sham 0.1 vs IDD 1.0），JBT显著抑制至0.3，使椎间盘基质从净分解转向净保存。ELISA检测显示JBT显著降低血清TNF-α（304.6→99.2 pg/mL）并恢复IL-10（44.2→160.1 pg/mL）。3-MA部分逆转上述分子变化，进一步确证体内自噬依赖性。
**3.4 JBT通过抗凋亡、线粒体保护和自噬激活协同保护NP细胞**
流式细胞术显示LPS将NP细胞总凋亡率从4.1%诱导至29.1%，JBT降至14.5%。JC-1染色显示JBT恢复LPS引起的ΔΨm去极化（JC-1红/绿荧光比值：87.5→69.8→82.7），DCFH-DA检测确认JBT减轻LPS诱导的ROS蓄积。免疫荧光显示JBT逆转LPS诱导的Bax升高、Bcl-2减少，并增加LC3斑点密度。Western blot确认JBT显著逆转Bax/Bcl-2比值，增加LC3-II、降低p62/SQSTM1，同时抑制p-p38MAPK和p-NF-κB p65。ELISA确认JBT显著抑制NP细胞上清液中TNF-α（384.9→101.9 pg/mL）和IL-1β（260.5→72.8 pg/mL）的分泌。
**3.5 JBT体外促进巨噬细胞M2极化**
流式细胞术分析显示，LPS使CD197+（M1）细胞从32.4%升至52.4%，CD206+（M2）细胞从30.9%降至28.1%，M1/M2比值升至1.9。JBT处理使CD197+降至18.9%，CD206+升至49.7%，M1/M2比值降至0.4。免疫荧光在单细胞水平确认JBT降低TNF-α、升高IL-10并增加LC3斑点密度。ELISA确认JBT显著抑制LPS诱导的TNF-α分泌并升高IL-10分泌。
**3.6 Atg5表达水平决定巨噬细胞中p38MAPK/NF-κB的抑制程度**
在正常巨噬细胞中，JBT显著增加LC3-II并降低p62/SQSTM1，同时显著抑制p-p38MAPK和p-NF-κB p65。在Atg5-OE巨噬细胞中，增强的自噬能力伴随进一步LC3-II蓄积和接近完全的p62清除。在Atg5-KD巨噬细胞中，自噬能力严重受损：即使JBT处理后LC3-II蓄积仍明显受损，p62保持升高，p-p38MAPK和p-NF-κB p65的抑制不完全。定量分析显示JBT在正常、Atg5-OE和Atg5-KD巨噬细胞中分别将p62降低约75%、83%和27%，将p-p38MAPK和p-NF-κB p65分别降低约91%、88%和45%。三个遗传背景的数据共同支持以下调节模块：JBT抑制p38MAPK/NF-κB并激活Atg5依赖性自噬；自噬性p62清除巩固NF-κB抑制；该模块的幅度由Atg5表达水平双向决定。
**四、讨论与结论**
本研究为JBT治疗IDD的治疗活性提供了系统的机制表征。p38MAPK与自噬激活之间的层级关系仍未完全解析。研究者指出，p38已被证明可通过Gadd45β–MEKK4通路磷酸化ATG5 Thr75从而抑制自噬，p38α还通过p38IP负调控mAtg9转运；若这些机制在椎间盘浸润巨噬细胞中发挥作用，则JBT介导的p-p38MAPK抑制预期可解除对Atg5依赖性自噬体形成的抑制性约束，使p38MAPK抑制位于自噬激活上游。这一层级模型仍有待在后续工作中通过选择性p38抑制剂和ATG5 Thr75磷酸化检测直接验证。
JBT的多成分化学组成为其多靶点活性提供了分子基础：蛇床子素具有抑制p38MAPK的活性，乳香酸是公认的NF-κB抑制剂，阿魏酸抑制MMP-13，龙胆苦苷抑制p38/ERK/JNK介导的信号传导。这些药效团在同一制剂中的共存解释了观察到的同步通路抑制、自噬激活和基质恢复。
研究存在若干局限性：缺乏临床阳性对照药物（如塞来昔布或雷帕霉素）；体外巨噬细胞实验采用鼠源RAW264.7细胞系而体内模型为大鼠，存在跨物种推断限制；质控策略为单标志物定量联合多组分指纹图谱相似度分析；采用JBT水提物直接给药方式；JBT极化巨噬细胞与NP细胞的Transwell共培养实验仍有待开展。
结论：JBT作为具有近三百年临床应用历史的经典中药复方，通过一条与连贯机制模型相符的调节级联减轻IDD——抑制p38MAPK/NF-κB通路、激活Atg5依赖性自噬、通过自噬–p62–NF-κB调节模块促进巨噬细胞M1向M2极化，并与NP细胞凋亡减轻和椎间盘结构完整性保存相关联。HPLC指纹图谱和多组分相似度分析揭示了该制剂的多种化学成分复杂性。这些发现为JBT在退行性脊柱疾病中的传统应用提供了机制支持，并为其在临床IDD管理中的合理评估提供了框架。
