用于流式细胞术鉴定人单核细胞的方法评估：TLR2可能是一种最佳标志物

《Immunology》：Evaluation of Methods for Identifying Human Monocytes by Flow Cytometry: TLR2 May be an Optimal Marker

　　

单核细胞在多种疾病状态（包括感染、自身免疫、心血管疾病和恶性肿瘤）的病理生物学中发挥关键作用。利用流式细胞术的研究揭示了单核细胞生物学的复杂性，包括鉴定出三种人单核细胞亚群：经典型（CD14^pos CD16^neg）、中间型（CD14^pos CD16^pos）和非经典型（CD14^neg/dim CD16^pos）。然而，不同研究之间用于流式细胞术鉴定单核细胞的圈门策略存在显著差异，这可能对结果产生重大影响并妨碍可重复性。但据研究人员所知，尚无既往研究评估过多种不同圈门策略用于鉴定人类循环单核细胞总群体的情况。本研究分析了健康供体外周血单个核细胞（PBMCs，n=10），通过流式细胞术比较了七种常用的定义人单核细胞的圈门策略：（1）阴性选择（CD3^neg CD19^neg CD56^neg CD66^neg）、（2）FSC-SSC、（3）CD14^pos、（4）CD64^pos、（5）HLA-DR^pos、（6）CD14—HLA-DR和（7）TLR2^pos。研究表明，不同圈门策略对非经典型单核细胞的计数影响显著，但对经典型和中间型单核细胞群体的影响较小。与阴性选择圈门（被视为参考标准）相比，基于FSC-SSC的圈门显示其他细胞类型的污染程度最高，而CD14^pos、CD64^pos、CD14-HLA-DR和HLA-DR^pos圈门显示对单核细胞（尤其是非经典型单核细胞）的错误排除程度最高。相比之下，TLR2^pos圈门在与阴性选择圈门比较时，既表现出最少的污染，也表现出最少的单核细胞错误排除。这些基于“手动圈门”的结果得到了更客观的t-SNE和聚类分析的支持。总之，TLR2^pos圈门和基于阴性选择的圈门均显示出对真单核细胞的最小污染和排除，其中TLR2^pos圈门产生了总体最纯的单核细胞群体。因此，采用更统一的单核细胞分析圈门策略（例如基于TLR2的圈门策略）可能会提高数据质量和实验室间的可重复性。

**论文解读：基于TLR2的圈门策略优化人单核细胞流式鉴定**

**研究背景与意义**

单核细胞是固有免疫系统的重要组成部分，能够从血液迁移至组织并分化为巨噬细胞。过去几十年，通过流式细胞术对外周血单核细胞亚群的分析，已使研究人员认识到单核细胞在冠状动脉疾病、多种恶性肿瘤、感染和自身免疫性疾病等病理过程中的重要意义。自20世纪80年代末以来，基于CD14和CD16的表达，流式细胞术已能够区分三种人单核细胞亚群：经典型（CD14^pos CD16^neg）、中间型（CD14^pos CD16^pos）和非经典型（CD14^dim/neg CD16^pos）。然而，文献中用于流式鉴定单核细胞的圈门策略差异极大，导致研究间难以比较。尽管阴性选择圈门被一些研究者视为“金标准”，但该方法耗费抗体、需要复杂抗体组合，并存在非特异性染色导致错误排除单核细胞的风险。同时，尚无研究系统比较多种常用圈门策略对“总外周血单核细胞群体”的识别准确性。基于此，研究人员开展了一项系统性比较研究，评估七种常用圈门策略在健康人PBMCs中定义总单核细胞群体及亚群的能力，旨在寻找更准确、可重复且简便的圈门方案。该研究成果发表于《Immunology》。

**主要技术方法**

研究人员从丹麦奥胡斯大学医院血库获取10例匿名健康供体棕黄层，经密度梯度离心分离PBMCs，冻存后统一解冻进行流式染色。使用基于Mair等人的抗体方案，包括CD45、CD14、CD16、CD64、HLA-DR、TLR2、CD3、CD19、CD56、CD66等标记。样本在LSRFortessa流式细胞仪上采集，数据经FlowJo软件补偿和分析。比较七种圈门策略：FSC-SSC、阴性选择（CD3^neg CD19^neg CD56^neg CD66^neg）、CD14^pos、CD64^pos、HLA-DR^pos、HLA-DR^posCD14^pos和TLR2^pos。同时，研究还利用t-SNE降维和X-shift无监督聚类分析进行客观验证。

**研究结果**

**3.1 文献概览**
研究人员系统检索了2017年1月至2026年6月PubMed中“流式细胞术”和“单核细胞”相关文献，最终纳入542篇。结果显示，阳性选择策略占42.6%，其中CD14^pos圈门最常见（24.5%），FSC-SSC占33.7%，阴性选择占23.6%，而TLR2^pos仅占0.92%。FSC-SSC使用比例近年有所下降。这表明圈门策略存在巨大方法学差异，且阴性选择虽被视为金标准，但实际使用率不足四分之一。

**3.2 七种圈门策略的比较**
研究人员对同一组健康供体PBMCs分别采用七种圈门策略，以CD45^pos活单细胞为总细胞基数。结果显示，阴性选择得到的总单核细胞比例显著高于其他策略（24.9% vs. TLR2^pos 22.8%，p<0.05）。亚群分析中，所有阳性选择策略的经典型和中间型单核细胞比例均显著高于阴性选择；非经典型单核细胞在不同策略间变异最大，其中HLA-DR^posCD14^pos圈门的比例最低（3.68%），显著低于阴性选择（10.1%），而TLR2^pos圈门的结果（9.27%）与阴性选择无显著差异。阴性选择的“未分类”单核细胞（CD14^dim/neg CD16^neg）比例高达13.6%，显著高于其他策略，TLR2^pos仅为4.34%。

**3.3 污染与错误排除评估**
以上述阴性选择圈门为参考标准，研究人员将阴性选择门叠加到其他六种圈门所定义的单核细胞群体上，计算非单核细胞污染比例。结果显示所有策略均存在一定污染，其中FSC-SSC污染最严重（总群体约7%），尤其在非经典型和未分类亚群中；而TLR2^pos的污染在所有亚群中均为最低，且非经典型污染未达统计学显著性。相反，将各阳性选择门或FSC-SSC门叠加到阴性选择所定义的单核细胞群体上，评估对“真单核细胞”的错误排除。结果显示，CD14^pos、CD64^pos、HLA-DR^pos和HLA-DR^posCD14^pos均导致大量非经典型单核细胞被排除，而TLR2^pos的排除最少（总群体约12.8%），被排除细胞多为树突状细胞亚群（pDCs、CD1c^pos mDCs、CD141^pos mDCs）或嗜碱性粒细胞样细胞，提示这些细胞实际是被阴性选择策略错误纳入的“污染”细胞，而非真单核细胞。

**3.4 t-SNE与聚类分析验证**
研究人员利用t-SNE降维对每例供体的CD45^pos活单细胞进行可视化，并将各圈门策略定义的单核细胞亚群反向映射到t-SNE图上。结果显示，经典型、中间型和非经典型单核细胞在不同圈门策略下定位一致，而“未分类”群体定位差异较大。直方图显示CD14、CD64和HLA-DR在非经典型单核细胞上表达较低，而TLR2在所有亚群上均匀高表达，进一步支持TLR2作为泛单核细胞标志物的优势。采用X-shift聚类分析（结合Euclid和Cluster Explorer质量评估）后，鉴定出13个细胞簇，包括单核细胞亚群、DC亚群、T/B/NK细胞、粒细胞、嗜碱性粒细胞及未知群体。聚类分析显示，TLR2^pos圈门所获群体中非单核细胞污染最少（<5%），而阴性选择圈门的非经典型污染达13.8%；在错误排除方面，除阴性选择和TLR2^pos外，其他策略均不同程度排除非经典型单核细胞，与手动圈门结果一致。

**3.5 TLR2染色对单核细胞活化的影响**
为排除TLR2抗体染色可能激活单核细胞并改变表型标志物表达的影响，研究人员比较了有无TLR2染色的标准方案，以及TLR2染色后稀释培养2.5小时的方案。结果显示HLA-DR、CD69、CD86和CD163的表达均无明显变化，表明TLR2染色不引起可检测的激活效应。

**讨论与结论**

本研究表明，不同圈门策略对单核细胞尤其是非经典型和未分类亚群的鉴定结果影响显著。FSC-SSC圈门主观性强且污染严重；CD14、CD64和HLA-DR阳性选择会错误排除非经典型单核细胞；而仅依赖CD3、CD19、CD56和CD66的阴性选择虽污染相对较少，但会纳入DC和嗜碱性粒细胞等非单核细胞，其质量取决于排除标志物的选择。TLR2^pos圈门在污染最小化和真单核细胞保留方面均表现最优，且染色不激活单核细胞。结合近年OMIP方案中提出的TLR2联合阴性选择策略，本研究建议流式细胞术领域采用更统一的单核细胞圈门策略，尤其是基于TLR2的方案，以提高数据的可靠性和实验室间可比性。研究结论为：在健康人PBMC样本中，TLR2是定义总单核细胞群体最具前景的单标志物，能有效避免错误排除和污染；在无法进行完善阴性选择的场景下，TLR2可作为泛单核细胞标志物推荐使用。