《Immunological Reviews》：What Antibody Repertoires See: Structural and Immunogenetic Insights Into Influenza A Virus Hemagglutinin Recognition
人类感染甲型流感病毒（Influenza A virus, IAV）或接种其疫苗，一直是理解人类抗体库（antibody repertoire）如何识别病毒糖蛋白（viral glycoprotein）的最具信息量的体系之一。数十年来，抗体分离、库测序（repertoire sequencing）、谱系追踪（lineage tracing）、血清学（serology）、病毒抗原进化（antigenic evolution）及结构生物学（structural biology）的研究表明，抗体识别并非仅仅是“靶向哪个表位（epitope）”的问题。相反，病毒血凝素（hemagglutinin, HA）上的每一个表面都为免疫系统呈现了一个独特的结构难题。通过感染和疫苗接种的反复暴露，加之持续的抗原漂移（antigenic drift），形成了复杂的免疫历史，并揭示了哪些病毒表面在抗体压力下发生进化。结构研究通过展示抗体库如何解决表位特异性识别问题，彻底改变了该领域。某些表位，如HA中央茎部（central stem），招募高度刻板的遗传与结构解决方案。其他表位，如受体结合位点（receptor-binding site, RBS），则可被遗传上多样的抗体接近，这些抗体汇聚于受体模拟（receptor mimicry）的共同结构解决方案。其他表位，包括侧向补丁（lateral patch）、锚定区（anchor）、头部界面（head interface）及头-茎连接区（head-stem junction），则揭示了库约束（repertoire constraint）的中间模式。总之，这些例子表明，抗体库所“看见”的内容由病毒糖蛋白结构、B细胞前体可用性、体细胞进化（somatic evolution）及群体水平免疫球蛋白多样性之间的相互作用所决定。
1 引言：流感血凝素作为模型抗原
甲型流感病毒（IAV）感染和疫苗接种是研究体液免疫（humoral immunity）的强大模型。很少有病原体被如此广泛或如此长期地研究。一个多世纪的病毒学、流行病学、免疫学和结构研究，已产生了对病毒进化与宿主免疫反应之间相互作用的无与伦比的理解。尽管有季节性疫苗和抗病毒疗法，IAV仍持续在全球传播，每年导致数百万感染和数十万人死亡。周期性大流行可导致更大规模的死亡率，强调了这些病毒带来的持续公共卫生负担。由于IAV在免疫压力下持续进化，它们为研究抗体库如何识别、适应并记忆快速变化的抗原提供了独特机会。
流感病毒分为四种主要类型，A、B、C和D，其中前三种感染人类。本综述聚焦于甲型流感病毒（IAV），其导致大多数季节性流行和所有已知的流感大流行。IAV根据其两种主要表面糖蛋白血凝素（HA）和神经氨酸酶（neuraminidase, NA）的抗原特性进一步分类。已鉴定出19种HA和11种NA亚型，在人类和动物病毒中产生了广泛的抗原多样性。IAV进化发生在人类群体中，也发生在动物储存宿主中，特别是鸟类和猪。由于体液免疫主要针对HA，免疫压力有利于积累减少被预先存在的抗体识别的突变。这一过程称为抗原漂移（antigenic drift），驱动季节性流感疫苗的定期重新配方，尽管选定的疫苗株并不总是与随后传播的病毒紧密匹配。更突然的抗原变化可通过抗原转变（antigenic shift）发生，其中基因重配产生携带新型HA（有或无新型NA）的病毒，人类群体对此几乎没有预先存在的免疫力。
甲型流感病毒是具有分节段、负义RNA基因组的包膜病毒。尽管其内部蛋白在复制、组装和免疫逃逸中发挥重要作用，体液免疫的主要靶标是表面糖蛋白HA和NA，它们分别介导病毒进入和释放。血凝素是病毒表面最丰富的蛋白，因此构成中和抗体的主要靶标。HA作为前体蛋白HA0合成，在病毒膜上三聚化，然后被宿主蛋白酶切割成两个功能亚基HA1和HA2。这一切割事件对感染性至关重要，因为它启动了病毒进入所需的融合机制。HA1亚基含有受体结合位点（RBS），介导与宿主细胞上含唾液酸受体的附着。相比之下，HA2亚基含有驱动内体酸化后膜融合的融合装置。结构上，HA1形成大部分球状头部结构域，而HA2和部分HA1构成更保守的茎部结构域。
NA执行互补功能，切割末端唾液酸以促进病毒粒子释放并防止聚集。尽管NA特异性抗体可对保护做出实质性贡献，本综述聚焦于HA，即更丰富的病毒糖蛋白和中和抗体反应的主要靶标。
对这些表面抗原的抗体反应多样性源于产生B细胞库的遗传机制。B细胞通过膜结合和分泌型免疫球蛋白的可变结构域识别三维分子表面，即表位。这些可变结构域通过V(D)J重组产生，将免疫球蛋白基因片段组装成独特的重链和轻链序列。连接区多样化通过重组连接处的核苷酸添加和删除进一步增加库多样性。抗原暴露后，活化的B细胞进入生发中心，其中体细胞超突变（somatic hypermutation）将额外突变引入免疫球蛋白基因。选择以改善结合逐步精炼抗原识别并增加抗体亲和力。
这些机制共同产生极其多样的抗体库，理论估计超过1012种独特受体。这种多样性表明每个个体应产生大致独特的抗原识别解决方案。然而，令人惊讶的是，情况并非总是如此。一小部分但在生物学上重要的抗体克隆型在个体间共享。这些所谓的“公共库”（public repertoires）在常见感染和疫苗接种后反复观察到，通常利用相似的种系基因、互补决定区（CDR）架构和结合模式。公共抗体反应的存在表明某些表位施加结构约束，有利于特定互补位（paratope）解决方案。这一观察提出了免疫学中的一个基本问题：表位的结构特性在多大程度上可以决定其同源抗体反应的遗传和分子特征？
这一问题对甲型流感病毒尤为可处理。单克隆抗体发现、库测序、谱系追踪、血清学、病毒抗原进化和结构生物学的整合，为将抗体遗传学和克隆进化直接连接到表位识别提供了前所未有的机会。
从这些研究中出现的一个核心教训是，抗体识别不仅仅是靶向哪个表位的问题。相反，每个抗原表面都为免疫系统呈现了一个独特的结构挑战。表位可及性、保守性、几何形状、糖基化和功能约束的差异都影响哪些B细胞克隆可以参与靶标以及这些克隆随后如何成熟。这些特性因此有助于塑造免疫优势层级、免疫记忆、印记以及后续暴露后回忆反应的特异性。
HA在历史上主导了抗体文献，因为它以约为NA五倍的过量存在，在病毒粒子表面密集排列，并且是中和抗体的主要靶标。靶向HA的抗体可以直接阻断受体附着、抑制膜融合、去稳定三聚体糖蛋白，或招募Fc介导的效应机制以消除受感染细胞。因此，我们目前对抗体汇聚、广谱中和抗体和免疫印记的大部分理解都源于对HA特异性反应的研究。
理解抗体库所“看见”的内容因此需要的不仅仅是编目病毒表位。它需要定义病毒抗原施加的结构约束如何与种系抗体多样性、亲和力成熟、免疫历史和群体水平变异相互作用，以塑造可被招募和选择的抗体。凭借其无与伦比的免疫学、库测序和结构数据深度，流感病毒为解决这些问题提供了卓越框架。检查不同表位如何偏好特定遗传和结构解决方案，可以揭示支配体液免疫组织和进化的普遍原理。
2 群体汇聚与谱系进化
流感抗体库表现出显著的群体水平汇聚。从无关个体分离的单克隆抗体经常靶向相同的HA表面，使用高度相似的结合模式。充分表征的例子包括IGHV1-69介导的中央茎部表位识别、通过唾液酸模拟（sialic acid mimicry）结合HA的受体结合位点（RBS）抗体，以及针对HA锚定表位的VH3/VK3限制性抗体。这些反复出现的抗体类别表明，尽管V(D)J重组产生巨大的理论多样性，保守的流感表位反复选择有限的一套遗传和结构解决方案。
这些公共或汇聚抗体反应的存在表明某些HA表位对抗体识别施加强约束。有效参与这些保守病毒表面可能需要特定结构特征，从而限制能够实现广泛反应性的抗体解决方案范围。因此，无关个体通常产生使用相似种系基因、共享特征性CDR基序并采用几乎相同结合足迹的抗体。这种汇聚在针对茎部、锚定区和RBS表位的广谱中和抗体中尤为突出。
尽管种系基因使用可通过种系编码氨基酸残基的理化特性强烈影响表位偏好，流感特异性B细胞谱系通常经历广泛的亲和力成熟。其推断的未突变前体通常显示对当代HA抗原很少或没有可检测的结合。许多此类谱系可能反而是由暴露于早期流感毒株（在个体童年期传播）引发的，并通过反复抗原刺激维持。体细胞超突变随后引入增加亲和力、拓宽反应性并保持对进化病毒变体识别的突变。
重要的是，亲和力成熟不仅仅是加强预先存在的相互作用。体细胞突变可以产生新的抗原接触或改变环构象，允许抗体谱系在保持对保守表位识别的同时显著改变其结合足迹。这种结构可塑性使得尽管与最初引发反应的毒株有相当大的序列分歧，仍能持续识别抗原漂移变体。这些进化轨迹提供了B细胞谱系如何获得特异性、效力和广度的分子记录。
总体而言，流感免疫反映了多样性与约束之间的平衡。适应性免疫系统可以产生广泛的抗体特异性，然而保守的流感表位在无关个体间反复选择相似解决方案。种系编码特征、亲和力成熟、免疫历史和人口因素共同塑造这些反应。定义这些力量如何相互作用以产生汇聚抗体库，对于理解公共抗体反应和设计可重复引发广谱保护性免疫的疫苗至关重要。
3 流感血凝素的结构脆弱性
HA是同源三聚体糖蛋白，在病毒进入期间介导受体结合和膜融合。每个HA原体由含有受体结合位点（RBS）的球状头部、容纳融合机制的更保守茎部结构域以及膜近端锚定区组成。三聚体组装还产生在分离原体中不存在的四级表位。流感HA分为两个主要系统发育组，在序列、茎部架构、糖基化和抗原特性上不同。尽管HA的整体结构和功能保守，这些组特异性差异塑造了抗体如何接近和参与HA表面。
HA因此呈现了一个结合高度可变和高度保守表面的复杂抗原景观。球状头部含有在免疫压力下快速突变的免疫优势位点，而保守表位分布在RBS、茎部、锚定区、头部三聚体界面和头-茎界面上。许多这些保守区域部分遮蔽或结构受限，为B细胞识别创造了独特挑战，并将交叉亚型或交叉组反应性限制在相对较少的抗体解决方案中。与此原则一致，对超过70种广谱中和抗体（bnAbs）的调查确定了五个反复出现的脆弱位点：茎部疏水沟、RBS、头部三聚体界面、融合肽区域和残留酯酶亚结构域。因此，HA表位不仅在保守性上不同，而且在可及性和对抗体介导中和的易感性上不同。
在这些靶标中，RBS代表HA头部上最重要、保守的脆弱性之一。由130环、150环、190螺旋和220环形成，RBS介导病毒附着到含唾液酸的糖脂和糖蛋白上。许多bnAbs通过模拟唾液酸参与的关键特征靶向该区域，通常使用保守结构基序接触RBS底部的Y98、W153、H183残基。尽管其功能保守，RBS凹陷在免疫优势和抗原可变的头部结构域内。抗体因此必须几乎平行于糖蛋白三重轴接近HA，以将一个或多个CDR环投射到受体结合口袋中，从而通过天然配体的分子模拟阻断受体参与。由于RBS在病毒表面保持暴露，针对它的抗体通常由感染和疫苗接种引发，构成多克隆免疫反应的重要组成部分。
HA上典型的免疫优势和高度可变表位聚集在RBS周围，构成了大部分毒株特异性抗体反应。然而，头部结构域内也存在额外保守表位。一个这样的区域是侧向补丁（lateral patch），位于HA头部侧面。该位点最初通过CL6649的研究表征，该抗体分离自2009年大流行H1N1疫苗临床试验的参与者。该表位随后在群体中变得足够靶向，逃逸变体出现并全球传播，最终促成疫苗株更新。最近的冷冻电子断层扫描研究表明，侧向补丁可能参与病毒粒子表面密集排列的HA-HA接触。其在高级HA组织中的潜在作用，加上其在完整病毒粒子上的部分遮蔽，可能有助于解释其在多个亚型中的保守性。该位点内逃逸突变的出现尽管如此表明，即使是相对保守的头部表位，在群体水平靶向时也能经历实质性免疫选择。
针对受体结合位点或侧向补丁的抗体通常具有强效中和活性，尽管它们可通过不同机制作用。RBS定向抗体阻断受体附着，而侧向补丁抗体可能空间遮蔽RBS或破坏高级HA组织从而干扰病毒进入。其他保守头部表位通过不同机制支持保护。例如，头部三聚体界面埋藏在相邻HA原体之间，通过HA三聚体的瞬时构象波动（或“呼吸”）变得可及。由于该表位部分遮蔽且免疫亚显性，它经历相对较少的抗原漂移，并在流感亚型间保持高度保守。三聚体界面抗体因此通常显示广泛结合活性，但在常规测定中中和活性弱或缺失。FluA-20是此类的一个充分表征例子。尽管中和活性有限，该类抗体可通过Fc介导效应机制赋予稳健保护。
HA头部内另一个保守脆弱性是残留酯酶（VE）亚结构域。位于HA头部侧面，该表位占据结构受限环境，可能有助于其保守性。与许多三聚体界面抗体不同，VE定向抗体通常直接中和。根据抗体及其参与模式，保护可能源于抑制受体结合、干扰病毒融合或破坏病毒释放。这种机制多样性突出了HA头部内保守表位的功能复杂性。
位于病毒膜近端，HA茎部包含病毒融合机制，因此受到限制序列变异的功能约束。因此，它是流感病毒表面最保守的区域之一。许多茎部定向抗体识别跨系统发育组共享的结构元件。这种保守性与至少某些类别茎部定向抗体抑制的易感性相结合，使茎部成为广谱中和抗体研究和通用流感疫苗开发的主要焦点。
在HA基部，融合和膜近端亚结构域形成锚定表位，包括HA2内保守的β折叠。靶向该区域的抗体通常依赖种系编码残基，可介导广泛中和。尽管保守，锚定区呈现实质性可及性挑战。其靠近病毒膜限制了允许的接近角度，而病毒粒子上HA三聚体的密集排列创造了拥挤的分子环境，进一步限制抗体访问。膜嵌入HA的瞬时摆动运动可能仍足以暴露表位，允许在完整病毒粒子上进行抗体参与。类似可及性约束影响其他保守茎部表位。例如，茎部螺旋高度疏水并被聚糖大量遮蔽，尽管其强序列保守性，仍产生阻碍抗体参与的空间屏障。
内体酸化后，HA经历戏剧性构象重排，将融合前三聚体转换为其融合后结构。这一转变暴露新的抗原表面，如长α螺旋（LAH）和β发夹，仅在融合激活后才可及。针对LAH或β发夹的抗体表现出交叉组反应性，主要通过Fc依赖性效应功能而非直接中和提供保护。这些发现表明，瞬时构象状态可以产生具有保护潜力的保守抗体靶标。
HA上继续鉴定出额外保守脆弱性。一个最近描述的表位称为内侧连接区（medial junction），位于保守的HA2中央螺旋和HA头部的残留酯酶亚结构域之间。靶向该位点的抗体可识别H1、H2和H5 HA，将内侧连接区确定为融合前三聚体上的保守、交叉反应脆弱性。
多克隆表位作图（EMPEM）研究表明，抗体靶向在流感亚型间差异显著。H1感染或疫苗接种后，抗体反应通常集中在中央茎部和锚定表位，头部定向特异性相对较少。相比之下，H3反应倾向于产生较少抗体但靶向更广泛的头部表位，与H3头部的强免疫优势和快速抗原进化一致。H5N1疫苗接种后也观察到不同时间模式。预先存在的茎部定向记忆反应快速出现并持续，而从头头部定向抗体较晚出现并更快下降。总之，这些观察说明抗原结构和免疫历史如何相互作用以塑造亚型特异性抗体反应。
总体而言，流感HA的抗原景观由高度可变和免疫优势的头部定义，其驱动大部分毒株特异性抗体反应和抗原漂移。同时，HA包含分布在受体结合位点、茎部、锚定区、头部界面、融合肽、疏水沟和残留酯酶亚结构域上的多个保守脆弱性岛屿。这些区域保持保守，因为它们受必需结构或功能角色约束，因此不能轻易容纳突变而不损害病毒适应性。
4 HA受体结合位点抗体：结构汇聚与免疫遗传学约束
RBS定向抗体在感染最早阶段作用，通过阻断病毒附着到宿主细胞。由于末端唾液酸残基参与对病毒感染性至关重要，尽管周围HA表面广泛抗原漂移，RBS架构仍保持功能约束。因此，RBS是广谱中和抗体的主要靶标。
HA头部（因此RBS）的可及性允许抗体从广泛方向接近表位。RBS定向抗体因此显示出种系基因使用的显著多样性。结构表征的例子源自IGHV1-69、IGHV1-2、IGHV2-70、IGVH3-23、IGVH3-33或IGHV4-59。尽管这种遗传多样性，结构研究揭示了分子水平的显著汇聚。大多数RBS抗体不是依赖单一种系编码基序，而是独立进化出共同功能策略：宿主受体的分子模拟。
受体模拟提供了抗病毒免疫中结构汇聚的优雅例子。流感HA通过高度保守的氢键和疏水相互作用网络参与末端唾液酸。RBS定向抗体通过将其CDR环投射到受体结合口袋中反复重建这些相互作用。唾液酸羧酸盐的氢键网络位置由天冬氨酸侧链或主链羰基重现。相邻疏水或芳香残基通过插入保守Trp153周围的空腔模拟唾液酸乙酰氨基基团。
诸如CH65、C05、K03.12、5J8、F045-092、2G1和8M2等抗体均将其重链CDR3（或较少见HCDR2）插入受体结合口袋，重现唾液酸的关键相互作用，尽管源自不同V(D)J重排。例如，CH65由IGHV1-2编码，通过其19残基长HCDR3介导受体模拟，同时与周围HA表面形成额外接触。其推断未突变共同祖先（UCA）的重建表明，受体模拟相互作用在亲和力成熟前已存在，表明初始库含有内在能够采用这种结构策略的B细胞受体。亲和力成熟因此似乎优化与周围HA表面的接触，而非创建核心受体模拟相互作用。
类似原理支撑5J8的HCDR3主导识别。其Asp100b和Pro100a重现唾液酸参与的关键特征，而其对大流行H1病毒特征性Lys133a插入的依赖性说明RBS口袋周围结构特征如何决定抗体广度而不改变潜在受体模拟策略。
K03.12谱系进一步证明受体模拟单独不决定广度。该交叉反应、IGHV1-2编码谱系几乎完全通过异常长的26残基HCDR3识别H1和H3 HA，允许适应两种HA亚型间的结构差异。与IGHV3-23编码抗体C05的结构比较揭示了几乎相同的受体模拟相互作用，尽管谱系起源和亲和力成熟差异显著。然而，K03.12无法识别大流行H1病毒，因为这些毒株中的Lys133a插入空间位移HCDR3，而缺乏该插入的历史H1病毒仍允许结合。因此，抗体可以在保守受体口袋内汇聚于几乎相同接触，却因邻近结构特征改变表位可及性而在广度上差异显著。受体模拟因此是广泛中和的必要但非充分条件；与周围抗原表面的相互作用仍是亚型特异性的关键决定因素。
受体模拟的多功能性尤其被IGHV1-69抗体充分说明。尽管该种系通过其疏水HCDR2经典地与茎部识别相关，几种RBS定向抗体如2G1、8M2、1E04和F045-092证明相同种系支架可被重新用于识别不同表位。在2G1和8M2中，HCDR2中的标志性Phe54与不变Trp153形成π-π堆积相互作用，因此模拟唾液酸乙酰氨基基团。相比之下，F045-092主要通过异常长的二硫键稳定HCDR3识别RBS。其Phe53-Phe54基序仅与190螺旋有限接触，而延伸HCDR3深入穿透受体结合口袋。丙氨酸扫描实验证明该二硫键约束环内残基对跨多种H3毒株识别不可或缺，表明广度主要源于HCDR3架构而非经典种系编码HCDR2基序。因此，支撑遗传约束茎部反应的相同IGHV1-69支架也可支持HA头部上结构不同的受体模拟解决方案。
受体结合位点因此例证了结构汇聚远超遗传汇聚的表位。保守抗原表面可在分子识别水平约束抗体进化，而不规定单一种系解决方案。LPAF-a多供体类别提供了显著反例，证明即使在RBS反应中，高度刻板和种系依赖的抗体解决方案也能出现。
LPAF-a抗体由保守免疫遗传学特征定义，其中IGHV2-70通常与IGHD4-17配对。这些抗体不是仅依赖严格受体模拟，而是使用互补种系编码残基参与RBS。IGHV2-70编码的Ser32和Trp53-Asp54基序接触190螺旋和相邻HA原体，而IGHD4-17编码的Tyr97-Gly98-Asp/Ser99基序与RBS形成接触，将99位残基侧链定位为有利于羧酸盐模拟的构型。这些种系衍生元素共同贡献抗体-抗原界面的实质性部分，在无关个体间变化很小。
该发育途径似乎可重现：已鉴定出超过一百种LPAF样抗体，代表来自两名供体的57个独立谱系，其中大多数使用IGHV2-70/IGHD4-17组合。较小子集使用IGHV2-5，其编码相同保守HCDR2基序，表明结构解决方案更强烈依赖特定种系编码残基而非单一V基因身份。进一步限制到编码重链50位亮氨酸的等位基因，证明访问该抗体类别不仅由基因使用塑造，还由人类免疫球蛋白库内的等位变异塑造。
这些观察与经典IGHV1-69茎部抗体平行，其中种系编码Phe54的存在决定产生主要多供体茎部反应之一的能力。Corcoran及其同事进一步表明，许多东亚和南亚血统个体携带同时含有非允许IGHV1-69 * 04等位基因（缺乏Phe54）和IGHV2-70 * 15等位基因（缺乏Leu50）的单倍型。遗传性免疫球蛋白多态性因此可能同时限制对保守茎部和受体结合位点的公共抗体反应访问。免疫球蛋白位点的群体水平变异可能因此导致疫苗反应性的个体间差异，在设计针对全球多样化人群的种系靶向免疫原时应予以考虑。
RBS因此揭示了抗体库汇聚的灵活性和极限。在一个极端，多样化种系基因汇聚于基于唾液酸模拟的共同结构策略，证明保守抗原表面可施加结构约束而不规定独特遗传解决方案。在另一个极端，LPAF-a类别表明一些RBS定向抗体依赖特定V和D基因甚至特定免疫球蛋白等位基因。RBS因此不应被视为遗传无约束表位，而应视为可通过多种在免疫遗传学约束程度上差异显著的发育途径访问的景观。
5 HA侧向补丁抗体：保守头部表位的谱系、血清学和进化证据
尽管RBS是流感HA头部上表征最充分的保守表位，结构研究已鉴定出RBS外的额外脆弱位点。位于HA球状结构域侧面、邻近RBS并包含部分HA1 β折叠的侧向补丁表位，支持针对抗原多样化H1病毒的广谱中和抗体反应，同时在结构上区别于经典RBS。
侧向补丁识别的原型例子是CL6649抗体谱系，在2009年大流行H1N1单价疫苗接种后鉴定。该谱系成员识别跨越三十年和大流行的H1 HA。结构分析定义了其在HA头部侧面的保守足迹，将侧向补丁确立为RBS外广泛可及的脆弱位点。
2009年大流行H1N1病毒出现后不久，循环毒株在CL6649足迹内获得替换，最显著的是K166Q，其迅速在人类群体中固定。血清学研究表明针对涉及166位残基表位的抗体常见，支持该位点的群体水平免疫选择。后续毒株还获得S165N，在166位残基邻近引入聚糖，进一步减少侧向补丁抗体识别。
后续研究表明侧向补丁识别不限于单一抗体谱系。对抗体045-09 2B05及相关克隆的分析揭示IGHV3-23和经常IGKV1-33使用的富集。在从七名个体分离的十个代表性抗体中，每个克隆使用IGHV3-23、IGKV1-33或两者，许多共享HCDR3内介导与HA关键接触的保守Y-x-R基序。使用经典IGHV3-23/IGKV1-33配对的抗体也保留了针对携带侧向补丁周围替换的近期大流行H1N1病毒的中和活性，表明该免疫遗传学解决方案可能赋予对持续抗原漂移的增强韧性。
保守侧向表位可能超出H1的证据进一步支持该区域的更广泛相关性。H3特异性抗体ADI-85647识别H3 HA侧面结构相似位点。H7感染个体分离的H7.HK1和H7.HK2也观察到类似观察，表明不同流感亚型可能包含可比较的保守头部脆弱性，尽管序列分歧显著。然而，与H1侧向补丁反应不同，ADI-85647、H7.HK1和H7.HK2仍是孤立结构例子，似乎不匹配先前为H1鉴定的基因使用汇聚。
侧向补丁在表位汇聚谱中占据中间位置。其在病毒粒子表面的部分遮蔽，加上HA组织施加的约束，可能有助于其保守性。疫苗诱导的克隆扩增、反复V基因使用和以该区域为中心的抗原漂移表明它也是人类体液免疫的重要靶标。然而，与HA茎部或受体结合位点不同，导致侧向补丁抗体的发育途径仍定义不清。当前证据指向特定种系组合的富集，尤其是H1感染和疫苗接种情况下的IGHV3-23和IGKV1-33，但仍不清楚这些基因是否编码特权结构解决方案或仅代表几种可能识别模式中的一种成功途径。
6 HA中央茎部：种系约束与结构汇聚
HA茎部提供了保守病毒表位如何塑造抗体库汇聚的最清晰例子之一。与免疫优势和高度可变的球状头部不同，茎部具有限制抗原多样化的强功能约束。因此，HA膜近端区域包含两个主要保守脆弱位点——中央茎部和锚定表位——每个由跨多个无关个体分离的抗体类别识别。这些表位不是招募单一主导谱系，而是反复引发使用不同V(D)J基因组合却汇聚于相似结构解决方案的多种多供体抗体类别。这些反应共同说明保守抗原表面如何支持多种可重现发育途径。
中央茎部表位代表遗传约束抗体识别的原型例子。广谱中和茎部抗体如27F3、CR9114、F10和CR6261帮助定义了容纳融合机制的HA结构域内保守表位。这些抗体主要通过重链相互作用参与表位，并通过阻止病毒-宿主细胞膜融合所需构象重排来中和流感病毒。它们确立了通过靶向融合机制而非受体结合结构域实现流感强效中和的范式。后续结构研究表明，反复出现的茎部识别模式由种系编码重链特征塑造，使中央茎部成为种系定向抗原识别的最佳表征例子之一。
大多数经典茎部抗体使用IGHV1-69，其编码HCDR2尖端两个疏水残基Ile53和Phe54。这些残基理想定位以参与HA2中Trp21周围保守疏水沟。这种种系编码基序不限于流感免疫，说明IGHV1-69种系支架潜在更广泛的进化效用。然而在流感HA中，Phe54与保守茎部口袋的相互作用已成为经典IGHV1-69反应的定义分子特征。
结构分析表明这些抗体主要通过重链结合，轻链贡献很少或没有。识别依赖HCDR2和HCDR3残基形成的保守疏水I/MFY基序，包括Ile53、Phe54和Tyr98。这些侧链插入HA茎部上连续疏水口袋，为IGHV1-69介导识别以及更普遍的中央茎部表位识别提供分子基础。
访问该遗传约束反应还取决于编码疏水HCDR2基序的允许IGHV1-69等位基因。IGHV1-69 * 04等位基因编码Leu54替代关键Phe54，与降低的HA茎部结合相关。由于该等位基因在一些亚洲人群中更常见，IGHV1-69位点的遗传性变异可能影响产生经典茎部定向抗体的能力。
尽管这种显著遗传约束，中央茎部不招募单一发育解决方案。相反，已鉴定出越来越多的多供体抗体类别，它们使用不同种系基因和结合策略汇聚于该保守功能表面。这些包括反复出现的IGHV3-30抗体如FI6v3、39.29、3I14和d30_103。
