《Molecular Oncology》：p190A/ARHGAP35 and p190B/ARHGAP5 proteins in endometrial cancer: a novel cancer-relevant paralog interplay
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子宫内膜癌是全球主要的妇科恶性肿瘤之一。多项研究强调ARHGAP35是这类肿瘤中显著突变的基因。该基因编码p190RhoGAP-A（p190A），是小GTPase蛋白家族的主要调控因子。ARHGAP5是ARHGAP35的旁系同源基因（paralo
摘要专业翻译
子宫内膜癌是全球主要的妇科恶性肿瘤之一。多项研究强调ARHGAP35是这类肿瘤中显著突变的基因。该基因编码p190RhoGAP-A（p190A），是小GTPase蛋白家族的主要调控因子。ARHGAP5是ARHGAP35的旁系同源基因（paralog），编码p190RhoGAP-B（p190B）。通过分析人类子宫内膜癌样本，研究人员发现ARHGAP35和ARHGAP5基因突变存在共发生现象，并报道与健康组织相比，两者在肿瘤样本中的mRNA水平均表达下调。研究人员随后研究了p190A/B低表达对子宫内膜癌的影响以及两个旁系同源基因之间的关系。研究人员通过CRISPR/Cas9技术生成了p190A和p190B敲除（knockout, KO）的HEC-1-A细胞。研究表明，去除每个旁系同源基因均导致相似的肌动蛋白重塑表型，形成依赖于Rho/ROCK通路的交联肌动蛋白网络（Cross-Linked Actin Networks, CLANs）。此外，对p190A和p190B敲除细胞进行的蛋白质组学分析突显了相似的受影响细胞功能。最后，该研究证明了p190A与p190B之间的功能性相互作用，其中同时去除两个旁系同源基因对子宫内膜癌细胞是有害的，揭示了一个潜在的可干预脆弱性（actionable vulnerability）。
论文解读文章
一、研究背景与研究目的
子宫内膜癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，在西方世界位列女性癌症发病率第四位。绝大多数（超过90%）子宫内膜肿瘤确诊于50岁以上女性。历史上，Bokhman分类将子宫内膜癌分为两种主要类型：I型为低级别、雌激素相关、侵袭性较低且组织学上主要为子宫内膜样型；II型为临床侵袭性强、与激素无关、组织学上为浆液性和透明细胞型。TCGA分子分型进一步将子宫内膜癌分为四个亚型：POLE突变型（超突变型，预后良好）、错配修复缺陷型（MSI，超突变型）、TP53突变型（高拷贝数变异，预后差）以及无明显异常且低拷贝数变异型。尽管治疗策略不断进步，患者生存率显著改善，但仍有大量患者对治疗反应不佳，迅速出现复发和转移。因此，理解肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭的潜在机制对于探索子宫内膜癌治疗新靶点至关重要。
肿瘤外显子组测序已鉴定ARHGAP35为在14%的子宫内膜肿瘤中显著突变的基因，使其位列人类癌症中最常突变的30个基因之一。ARHGAP35基因编码p190RhoGAP-A（p190A），属于调控Rho家族小GTPase活性的GTPase激活蛋白（GTPase-Activating Protein, GAP）家族。该基因与其严格旁系同源基因ARHGAP5（编码p190B）共同存在。虽然ARHGAP35近期已在子宫内膜癌中得到研究，但其旁系同源基因ARHGAP5的状态和影响仍属未知。旁系同源基因反映了人类基因组的高度冗余性，是祖先重复基因，通常至少部分保留重叠功能。由于产生的缓冲效应，旁系同源基因比非旁系（"单拷贝"）基因更不可能对细胞生长至关重要。然而，两个旁系同源基因可能表现出合成致死性（synthetic lethality），即同时去除两者是有害的，而单独缺失可被耐受。鉴于癌细胞基因组常携带旁系同源基因的缺失和失活突变，旁系同源基因间的合成致死型相互作用为抗癌治疗提供了新的可能性。本研究聚焦于子宫内膜癌中p190A与p190B之间的相互作用，探讨这两个旁系同源基因作为潜在靶点的可能性，具体研究p190旁系同源基因在子宫内膜癌中的依赖性和相互作用。
二、主要技术方法
研究人员使用了多种关键技术方法开展研究。在临床样本层面，研究纳入了来自法国波尔多Bergonié研究所16例子宫内膜癌患者的肿瘤样本（2016年8月至2019年5月采集），由妇科病理学家复核组织学亚型、肿瘤分级、淋巴血管浸润和浸润深度，通过显微切割选取肿瘤和非肿瘤区域进行RNA提取。在细胞实验层面，研究人员使用CRISPR/Cas9基因组编辑技术，通过核糖核蛋白复合物转染在HEC-1-A子宫内膜癌细胞中分别敲除ARHGAP35或ARHGAP5基因，经有限稀释法分离单克隆细胞系并通过Sanger测序和Western blot验证敲除效果。研究还采用了RT-qPCR检测基因表达、Western blot分析蛋白水平、免疫荧光结合共聚焦显微镜观察肌动蛋白细胞骨架、IncuCyte?活细胞成像系统监测细胞增殖和迁移、基于质谱的非标记定量蛋白质组学（LC-MS/MS）结合Proteome Discoverer和CHIMERYS软件进行蛋白鉴定与定量，以及CellTiter-Glo?发光细胞活力检测法评估细胞活力。此外，研究人员还使用慢病毒介导的野生型（WT）和突变型p190A回补实验、siRNA干扰技术进行基因沉默、Rho激酶（ROCK）抑制剂Y-27632处理以及顺铂（cisplatin）药物敏感性实验。
三、研究结果
结果一：ARHGAP35和ARHGAP5基因表达在子宫内膜癌中均发生改变
通过分析TCGA PanCancer Atlas中529例子宫体子宫内膜癌（UCEC）样本数据，研究人员发现ARHGAP35和ARHGAP5基因的体细胞突变频率分别约为21%和10%，突变类型包括错义突变、无义突变和框内缺失，分布在整个编码序列上且无热点区域。值得注意的是，两个p190旁系同源基因的突变在TCGA队列中表现出强烈的共发生现象。在预后价值方面，同时携带ARHGAP35和ARHGAP5基因改变的肿瘤患者比仅有一个基因改变或无改变的患者预后更好。与正常样本相比，TCGA队列中子宫内膜癌的ARHGAP35和ARHGAP5 mRNA表达均显著下调，且两个旁系同源基因的表达呈正相关。研究人员在自有的33个样本（来自16例患者，其中24个肿瘤区域和9个非肿瘤区域）队列中通过qRT-PCR验证了TCGA数据，同样证实肿瘤样本中两个基因的表达较正常子宫组织显著下调，且表达呈显著正相关。在六种子宫内膜癌细胞系（HEC-1-A、HEC-1-B、KLE、RL95-2、AN3-CA和Ishikawa）中，两个旁系同源基因在mRNA和蛋白水平均共表达，但mRNA和蛋白水平并非严格相关，提示存在转录后和/或翻译后调控。此外，p190A和p190B的表达与编码基因的突变状态无关。
结果二：p190A和p190B蛋白改变影响子宫内膜癌细胞中的相似通路
研究人员利用CRISPR/Cas9技术在HEC-1-A细胞中生成了p190A-KO和p190B-KO细胞系，每种各选取两个独立克隆进行表型分析。去除一个旁系同源基因不会改变另一个的表达。由于p190蛋白是Rho家族成员的调节因子，研究人员首先分析了每种KO对肌动蛋白细胞骨架组织的影响。与GAP活性丧失一致，p190A-KO和p190B-KO细胞的F-actin染色均较WT细胞显著增加。回补实验证实，WT形式的p190A能完全恢复p190A-KO细胞的F-actin水平，而GAP结构域缺失的R997*突变体或癌症相关突变体（S866F或?865–870）则不能，表明KO细胞中观察到的效应确实依赖于p190的GAP活性。进一步分析F-actin组织发现，p190A-KO和p190B-KO细胞均出现不寻常的肌动蛋白重塑，形成规则的肌动蛋白纤维多边形网络结构，即交联肌动蛋白网络（CLANs），主要在人小梁网（HTM）细胞中有报道。分别有26%和21%的p190A-和p190B-KO细胞呈现CLANs，而亲本细胞仅为6%。α-辅助动蛋白（alpha-actinin）与网络内每个F-actin点共定位，确认这些结构属于CLANs。在HEC-1-B细胞中通过RNAi抑制p190A或p190B表达也能观察到这种特殊的F-actin组织。使用靶向Rho激酶ROCK的抑制剂Y-27632处理后，CLANs数量显著减少，证明p190-KO诱导的CLANs是通过HEC-1-A细胞中RhoA/ROCK活性增加而产生的。伤口愈合实验显示，与WT HEC-1-A细胞相比，p190A-KO和p190B-KO细胞的迁移能力分别轻度或显著降低，表明两个p190旁系同源基因的表达均为子宫内膜肿瘤细胞正常迁移所必需。综合分析表明，两个旁系同源基因在HEC-1-A细胞的肌动蛋白重塑、RhoA/ROCK通路激活和细胞迁移中发挥同等程度的作用，且p190A的缺失不被p190B补偿，反之亦然。
结果三：同时靶向p190A和p190B揭示子宫内膜癌细胞的脆弱性
研究人员对CRISPR产生的全部六个克隆（p190A-KO A-1、A-2、A-3；p190B-KO B-1、B-2、B-3）进行了基于质谱的全局蛋白质组学分析。在p190A-KO和p190B-KO细胞中共同鉴定到4159种蛋白质。与对照细胞相比，p190A-KO细胞中有536种蛋白质、p190B-KO细胞中有280种蛋白质的表达发生显著改变。通过Ingenuity Pathway Analysis进行功能关联分析发现，尽管改变的蛋白质不同，但两个KO细胞中受影响的信号通路相似。除与肌动蛋白细胞骨架改变相关的细胞组织和细胞运动通路外，还发现细胞死亡与存活、细胞增殖以及细胞对治疗的反应等通路发生改变。细胞增殖实验显示，p190A和p190B低表达对HEC-1-A细胞生长速率有轻微影响，其中p190B缺失的影响更大。在100 μm顺铂处理下，p190-KO细胞与WT细胞一样生长受到强烈抑制，表明p190A或p190B缺失未改变HEC-1-A细胞对顺铂的反应。为探索两个旁系同源基因之间的潜在合成致死性，研究人员在KO克隆中使用RNA干扰敲低另一个旁系同源基因。在p190A-KO细胞中去除p190B导致细胞生长显著下降，而在p190B-KO细胞中去除p190A仅产生较小影响，可能反映了沉默的阈值效应。在HEC-1-A和RL95-2细胞中仅使用RNA干扰进行单重和双重沉默实验，发现同时去除两个旁系同源基因在HEC-1-A和RL95-2细胞中均是有害的，而单独缺失在RL95-2细胞中可被耐受。细胞活力实验显示，在HEC-1-A、RL95-2和Ishikawa细胞中，仅缺失一个旁系同源基因在24小时后未能强烈损害细胞活力，但两个旁系同源基因同时缺失导致HEC-1-A和Ishikawa细胞活力显著下降，证实了上述鉴定的细胞死亡和存活通路。这些数据共同证明，降低p190A和p190B蛋白水平可降低细胞活力，揭示了子宫内膜肿瘤细胞的一个脆弱性，可能代表一种针对子宫内膜癌的潜在治疗策略。
四、讨论与结论
讨论部分指出，ARHGAP35/p190A和ARHGAP5/p190B是组织中普遍表达的旁系同源基因。本研究揭示了ARHGAP5基因在子宫内膜肿瘤中也有突变，尽管频率低于ARHGAP35。两个基因突变的共发生反映了旁系同源基因的相互作用，提示存在共同的突变产生机制。研究还发现ARHGAP35或ARHGAP5与POLE突变在子宫内膜癌中共发生。POLE基因编码DNA聚合酶Epsilon的催化亚基，其突变与聚合酶校对功能所需的核酸外切酶活性破坏相关。然而，正常子宫内膜组织的数据提示，ARHGAP35突变的发生并非由于DNA聚合酶Epsilon功能障碍所致，因为ARHGAP35是正常子宫子宫内膜上皮中最常突变的基因（突变样本比例为0.34），甚至比相应子宫内膜癌中更频繁，而正常子宫内膜中POLE突变频率极低。相反，POLE突变增加基因组不稳定性，可能导致新抗原形成增加，进而促进转化细胞的早期免疫清除，这可能解释了子宫内膜癌中ARHGAP35突变频率较正常子宫内膜降低的原因。
无论突变状态如何，ARHGAP35和ARHGAP5在肿瘤中的表达均较非肿瘤组织显著下调，且两个基因的表达在TCGA队列和自有队列中均呈正相关，提示两个旁系同源基因可能共享共同的调控机制，如启动子或增强子区域存在共同的转录因子结合位点，或三维染色质结构等进化约束可能促成这种协同表达。
在功能层面，p190A或p190B敲除导致细胞中肌动蛋白丝显著增加，这与p190蛋白作为Rho GTPase负调控因子的功能一致。与成纤维细胞中p190蛋白通过控制RhoA活性调节肌动蛋白应力纤维形成不同，子宫内膜癌细胞中p190缺失导致类似CLANs的测地线F-actin结构形成。CLANs被认为在青光眼相关眼压升高中通过使细胞和组织变硬而发挥作用。p190A或p190B低表达后子宫内膜癌细胞中出现CLANs，提示这些细胞可能以不同方式适应环境并增加子宫内膜硬度。这些肌动蛋白网络高度依赖于RhoA/ROCK通路，且对细胞迁移有害。
全局蛋白质组学分析表明p190A和p190B具有重叠功能，沉默每个旁系同源基因后改变的细胞功能相似。在细胞生长和活力实验中，去除一个旁系同源基因倾向于降低子宫内膜细胞生长和活力，同时去除两者影响更强。在一定阈值内，p190A和/或p190B水平降低可能因两种蛋白之间的缓冲效应而被癌细胞耐受；但低于该阈值（通过p190A和p190B共敲低模拟）时，旁系同源基因变得必需，其缺失是有害的。
研究结论：通过这项研究，研究人员强调了p190A和p190B蛋白在子宫内膜肿瘤细胞中的冗余性和功能性相互作用，揭示同时沉默这两个旁系同源基因可能产生一个可干预的脆弱性，为设计针对子宫内膜癌细胞的新型治疗策略开辟了新途径。
