夏科-马里-图斯神经病（Charcot–Marie–Tooth Neuropathy，CMTX3）复杂结构变异导致SOX3时空表达差异

《HUMAN MUTATION》：The Charcot–Marie–Tooth Neuropathy (CMTX3) Complex Structural Variation Causes Differential SOX3 Spatiotemporal Expression

　　

夏科-马里-图斯（Charcot–Marie–Tooth，CMT）神经病是一组临床与遗传异质性的疾病，以周围神经长度依赖性轴突变性为特征。研究人员此前将一种罕见X连锁CMT即CMTX3定位至Xq26.3-q27.1的5.7-Mb区间，并排除该连锁区间内所有已知基因的编码区突变。全基因组测序（Whole Genome Sequencing，WGS）随后识别出一段78-kb的8q24.3区域被重复并插入到CMTX3位点中HAPSTR2与SOX3之间。该78-kb插入包含ARHGAP39的部分转录本，在CMTX3家系中完全共分离，且在神经学正常对照中缺失。为保留CMTX3插入并在适宜神经元组织中研究其后果，研究人员由CMTX3成纤维细胞生成诱导多能干细胞（induced Pluripotent Stem Cells，iPSC）。对患者来源脊髓运动神经元（spinal motor neurons，sMN）进行批量RNA测序（RNA Sequencing，RNA-seq）后，因排除新型融合转录本形成及部分重复引起的剂量效应，将ARHGAP39判定为非致病。不同神经元分化阶段的CMTX3位点内候选基因NanoString表达分析识别出SOX3的时空失调。NanoString显示患者iPSC中SOX3表达降低；RNA-seq检测到CMTX3神经上皮祖细胞（neuroepithelial progenitor，NEP）中SOX3下调，并获定量蛋白质组学证实。鉴于CMTX3早发且进展相对迅速，这些数据将SOX3列为首选候选基因，与其作为发育神经系统最早表达的转录因子之一及神经元命运关键调节因子的作用一致。

《HUMAN MUTATION》刊发的该论文以CMTX3这一超罕见X连锁遗传性疾病为对象，回应了非编码区复杂结构变异（Structural Variation，SV）如何导致遗传性周围神经病这一未解问题。此前研究人员虽将CMTX3定位于Xq26.3-q27.1并发现8q24.3来源78-kb片段插入HAPSTR2与SOX3之间，但插入位于非编码区、不破坏已知CMT致病基因编码区，其功能后果与致病机制长期不明；同时ARHGAP39部分重复是否致病、邻近基因是否因调控景观改变而失调均缺乏在相关神经元模型中的证据。为突破仅用淋巴母细胞或测序数据推演的局限，研究人员构建患者来源iPSC并分化为脊髓运动神经元谱系，在发育不同阶段以多组学手段解析SV后果，从而判断CMTX3是否由局部基因调控紊乱而非新转录本产生所驱动。

作者所用主要关键技术方法包括：由CMTX3患者及无关对照成纤维细胞重编程获得iPSC（样本源于既往定位的三大家系共有祖先衍生患者及购买/外送对照）；将iPSC分化为尾侧神经上皮细胞（NEP）、运动神经元祖细胞（Motor Neuron Progenitor，MNP）、神经球与成熟脊髓运动神经元；以NanoString nCounter靶向检测CMTX3连锁区候选基因；以批量Poly(A) RNA-seq与deFuse、FusionCatcher、Arriba、StringTie、GffCompare、edgeR、DESeq2分析融合转录本、新转录本及差异表达；以TMT标记串联LC-MS/MS定量蛋白质组学验证转录组发现。样本队列为CMTX3患者来源细胞系n=1至n=3、对照n=3，反映超罕见病供体材料受限。

研究结果如下。3.1 CMTX3患者来源iPSC系表征：通过qRT-PCR与免疫荧光确认多能性，并以多重PCR检出SV断点连接片段，证明重编程后致病SV保留。3.2 由CMTX3患者来源iPSC系分化生成MNP与sMN：以OLIG2、MNX1、TUBB3免疫荧光及NanoString证明运动神经元身份与分化效率在患者与对照间无显著差异。3.3 患者来源sMN探索性RNA-seq未显示与CMTX3 SV相关的新型融合转录本或异常剪接：三种融合工具未检出跨Xq27.1与8q24.3插入段的致病融合；ARHGAP39相关事件也在对照出现；位点内29个位置候选基因中SOX3两克隆一致下调但未达多重校正显著。3.4 CMTX3患者未检测到部分重复ARHGAP39的过表达：NanoString双探针（重复区内/外外显子）在iPSC至sMN各阶段患者与对照无显著差异，排除ARHGAP39剂量致病。3.5 SOX3在CMTX3 sMN分化中呈时空失调：NanoString对SV两侧约3 Mb内21个候选基因的检测显示，iPSC阶段SOX3约5.7倍降低（log₂Ratio=-2.51，p=0.0012），尾侧NEP阶段仍呈降低趋势；NEP的RNA-seq中DESeq2将SOX3列为X染色体上唯一差异基因（log₂FC=-1.96，adj p=0.0015）。3.6 蛋白质组学证实CMTX3神经上皮细胞中SOX3下调：TMT LC-MS/MS在8000个定量蛋白中仅3个源于CMTX3连锁区，SOX3是唯一显著差异蛋白（log₂FC=-0.442，adj p=0.0213）。

讨论部分总结：研究人员指出Xq27.1热点复杂SV可通过重连顺式调控元件引起SOX3等邻近基因失调，同类机制已见于46,XX男性性反转、X连锁先天性多毛症及遗传性痉挛性截瘫（Hereditary Spastic Paraplegia，HSP）。既往淋巴母细胞中FGF13曾被疑为候选，但iPSC至sMN模型中FGF13无一致差异，SOX3成为唯一可重复失调的位置候选。SOX3属SOXB1亚族，维持神经祖细胞未分化状态并参与胶质发生；人SOX3编码区变异多致垂体功能减退等综合征，而CMTX3仅为早期、部分、时空受限的SOX3表达降低，或可解释其以周围神经表型为主而少伴广泛综合征。与HSP家系中SOX3因插入使远端增强子绝缘而下调相互独立印证。研究人员也强调尚缺SOX3回补/敲低功能扰动、施万细胞分化、单细胞/空间转录组与体内模型证据，且miRNA（MIR504、MIR505、MIR320D2）未纳入、家系背景可能干扰结果。

结论部分译文：总体而言，本研究凸显了解释遗传性神经病相关非编码结构变异的挑战。利用首个CMTX3神经元模型，RNA-seq与NanoString并得到定量蛋白质组学支持，汇聚出可重复的、患者特异性的SOX3降低，该降低限于发育早期，并与CMTX3插入驱动的时空调控紊乱一致。这些发现将SOX3置于CMTX3新的首选候选基因位置，并支持Xq27.1热点重排重塑局部调控架构的模型。总体看，这些数据是阐释CMTX3病理机制的重要一步，并进一步支持基因调控改变可能构成该神经病基础的观点。