在人源化猪模型中激活遗传定义性心脏病的患者相关致病变异

《Lab Animal》：Activating a patient-relevant pathogenic variant of a genetically defined heart disease in a humanized pig model

　　

进行性心肌病等复杂疾病通常无法在小动物或体外模型中得到充分重现。猪等大型动物物种提供了一种有价值的替代方案，但组成性遗传操作尚未以有效方式应用于猪，主要归因于生物学和后勤方面的限制。研究人员描述了受磷蛋白（phospholamban, PLN）介导的心肌病的人源化猪模型的生成，并比较了通过Cre介导重组激活致病性R14del突变的不同方法。在体细胞核移植（somatic cell nuclear transfer, SCNT）前对猪原代细胞进行Cre处理，以及将编码Cre的mRNA显微注射入受精卵，在产生携带激活的R14del突变的仔猪方面效率相似。另外，向仔猪施用编码Cre的腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）同样有效，尽管程度存在差异。总之，研究人员描述了一种在猪中建立复杂诱导性遗传性状的高效流程，并证明缺乏Cre驱动品系可以通过生殖期间或出生后的多种干预措施加以补偿。

**论文解读文章**

**研究背景**
越来越多的扩张型、肥厚型或致心律失常表型的心肌病被证实由（可能）致病的遗传变异引起，其表型外显率、严重程度和发病时间在患者群体中常存在差异，病理生理机制涉及与直接遗传缺陷看似无关的继发效应。小鼠虽常用于缺血性和肥厚性心肌病研究，但其心率极高且频率调节能力有限，结果难以直接转化至人类；相比之下，猪的心脏在大小、比例、灌注和瓣膜力学方面与人类高度相似，且可通过临床级电生理导管插入术和高分辨率标测进行研究。尽管CRISPR–Cas等高效基因组修饰工具已扩展了猪的基因修饰（genetic modification, GM）能力，但诱导性基因修饰（inducible GM, iGM）涉及在特定细胞类型或发育阶段通过切除、插入、倒位或交换基因组位点来切换基因功能，其实现复杂度更高。小鼠中成熟的Cre-lox系统依赖重组酶识别34 bp的lox片段，但猪的繁殖周期长、体型大、饲养成本高，难以直接套用组合杂交育种策略，因而亟需替代方案。

**研究概述**
研究人员针对受磷蛋白（phospholamban, PLN）c.40_42delAGA; p.(R14del)致病性变异导致的遗传性致心律失常性心肌病，将全面设计与先进GM策略及Cre介导的条件性致病变异激活相结合，成功建立了人源化猪模型。研究系统比较了三种Cre递送方法：SCNT前对猪原代细胞进行Cre处理、向受精卵显微注射编码Cre的mRNA、以及向仔猪静脉注射编码Cre的腺相关病毒。结果表明，前两种方法产生携带激活R14del突变仔猪的效率相似，AAV介导的产后激活也可实现变异表达但程度不一。该研究建立了在猪中高效建立复杂诱导性遗传性状的流程，证明缺乏Cre驱动品系可通过生殖期间或出生后的多种干预加以补偿，论文发表在《Lab Animal》。

**主要关键技术方法**
研究采用以下关键技术：（1）改良细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome, BAC）载体结合CRISPR/Cas9诱导双链断裂的同源重组技术，实现人源化PLN基因盒的定点整合；（2）体细胞核移植（somatic cell nuclear transfer, SCNT）技术，以经筛选及Cre处理的猪原代肾细胞为核供体产生奠基动物；（3）受精卵Cre-mRNA显微注射技术；（4）AAV2/9载体介导的Cre产后递送技术；（5）基于定量PCR的丢失野生型等位基因（loss-of-wild-type allele, LoWA）筛选及Sanger测序、限制性酶切指纹分析等基因分型方法。样本来源包括Swabian Hall猪原代肾细胞、Libechov小型猪品系受精卵以及UMC Utrecht生物样本库的PLN-R14del患者血液样本。

**研究结果**

**PLN翻译前景挖掘**
研究人员对12种哺乳动物的PLN基因组位点进行多序列比对，发现PLN基因整体相似性较低，同源性仅限于外显子1上游的潜在增强子元件、外显子1周围近端启动子区域及外显子2编码区。对7例人PLN-R14del携带者的长读长与短读长测序显示，PLN c.40_42del变异与3′-UTR中的rs12198461和rs1051429单核苷酸变异严格共分离，支持该患者群体源自单一奠基者事件。蛋白水平上，PLN跨膜结构域II、环状结构域及磷酸化位点S16和T17在哺乳动物中保守，而SERCA1和SERCA2中与PLN相互作用的结构域在所有受检哺乳动物中完全一致。

**PLN修饰策略**
研究人员设计了一种双盒（double-cassette）iGM策略：初始构型中，突变的PLN-R14del盒被上游元件沉默，该元件同时提供抗生素抗性、R14del有害情况下的救援策略，并允许在组合育种后实现huPLN-R14del与huPLN-WT的互补表达，从而在猪心脏中重建患者样等位基因组合（PLN^{huWT/huR14del}）。

**人源化猪PLN基因座**
研究人员将改良BAC载体与CRISPR/Cas9共转染猪原代肾细胞，测试的三个gRNA中两个有效（非同源末端连接突变率11–12%和40–41%）。经LoWA筛选和Sanger测序，从161个单细胞克隆中鉴定出8个候选克隆用于SCNT，最终获得3头存活和2头死产仔猪。定量拷贝数分析发现#11926品系存在>20拷贝的neo随机整合，遂将其剔除；#11809品系确认可遗传的huPLN-R14del按孟德尔规律分离，经outbreeding去除neo片段后建立突变群体。

**通过mRNA显微注射激活huPLN-R14del**
研究人员将huPLN-WT F1公猪精子授精的Libechov小型猪受精卵回收并显微注射编码密码子优化的Cre重组酶的mRNA，体外培养后58.33%的胚胎达到桑葚胚或囊胚阶段。移植后产下5头存活仔猪，基因型涵盖PLN^poWT/poWT、PLN^poWT/huWT和PLN^{poWT/huR14del}。皮肤与血液组织拷贝数分析结果一致，未检测到残留huPLN-WT或neo序列，证明无嵌合体现象。

**huPLN-R14del基因型的产后激活**
研究人员对4–8周龄仔猪静脉注射1.0×10¹⁵–1.0×10¹⁶ vp的编码Cre的AAV2/9病毒，并对左心室（LV）和右心室（RV）进行系统采样。未包被病毒处理21周后，基因组水平huPLN-R14del激活比例为LV 0.6–3.8%、RV 0.4–2.1%，转录水平达LV 9.7–27.9%、RV 0.9–13.4%。G2-cys PAMAM包被可改善激活效率；G2-myoP8包被在纯合huPLN^huWT