一种用于甲型流感病毒测序的改进型多片段RT-PCR方法：相比传统方法的性能提升和准备时间缩短

《Journal of Virological Methods》：An enhanced multisegment RT-PCR method for influenza A virus sequencing: Improved performance and reduced preparation time over traditional methods

　　

• 我们开发的院内多片段双池RT-PCR方法提升了扩增子质量。
• 该方法在读段产量和特异性方面均优于常规方法。
• 在全A型流感病毒基因组范围内实现了均匀且完整的基因水平覆盖。
• 匹配读段数量增加，同时背景噪音降低。
• 在人类、猪和禽类病毒中均获得了可靠的基因组范围覆盖。

引言
I型A流感病毒（IAVs）属于正黏液病毒科，其基因组特征为分节段的负义RNA（Hayden and Palese, 2009, Suarez, 2016）。病毒表面两种主要抗原——血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）——介导病毒感染的关键步骤，分别促进病毒进入宿主细胞和病毒释放（Wagner et al., 2002, Wu and Wilson, 2020）。IAVs的分类取决于这些糖蛋白的抗原特异性，包括18个已鉴定的HA亚型（H1–H18）和11个NA亚型（N1–N11）（Long et al., 2019, Sriwilaijaroen and Suzuki, 2022）。HA和NA类型的组合定义了不同的病毒亚型（Bosch et al., 2010）。持续的抗原漂移——即HA和NA基因中点突变的累积——导致抗原逐渐改变，从而帮助病毒逃逸免疫反应，并使疫苗配方需要定期更新（Kim et al., 2018, Petrova and Russell, 2018）。相反，抗原转变源于基因重配事件，即当两种不同的IAVs同时感染同一宿主时，发生基因片段的交换，从而产生能够引起流行病、兽疫或大流行的新型毒株（Hsieh et al., 2006, Lowen, 2017）。因此，全面理解流感病毒遗传学对于监测病毒进化、指导疫苗配方和制定有效的公共卫生干预措施至关重要（Peng et al., 2013; Mchardy and Adams, 2009）。

强有力的病毒学监测仍然是流感疫情管理的关键环节，为预测、追踪和减轻病毒传播提供了必需的数据。持续监测有助于刻画循环流感病毒株、发现流行病学趋势，并早期识别潜在的大流行风险（Budgell et al., 2015, Surveillance and System, 2012）。监测工作在挑选合适的疫苗毒株和实施及时的干预措施方面发挥着重要作用，例如在2008年季节中识别到季节性A(H1)毒株抗神经氨酸酶药物耐药性增加（Surveillance and System, 2012）。

历史上，基于聚合酶链式反应（PCR）的技术在流感病毒检测和表征中发挥了核心作用（Jester et al., 2018, Wo?niak-Kosek et al., 2014, Zhang and Evans, 1991）。具体来说，诸如RT-PCR等分子方法可实现精准诊断，从而支持快速的临床管理与公共卫生响应（Slomka et al., 2010, Vester et al., 2010）。尽管这些方法具有实用性，但常规PCR方法在灵敏度、特异性和全基因组覆盖范围方面存在局限性（Jester et al., 2018, Qian et al., 2025, Suarez et al., 2007）。值得注意的是，标准PCR方法往往无法在临床标本中检测低丰度的病毒RNA群体，这使混合感染以及影响病毒进化和传播模式的少数变异的识别变得复杂（Lee et al., 2016, Romanowska et al., 2008）。

测序技术的进步显著推动了流感病毒基因组学的发展，标志着从传统的Sanger测序向下一代测序（NGS）的转变。尽管Sanger测序于20世纪70年代问世，通过推动最早的完整病毒基因组测序工作（包括流感病毒）为病毒基因组学奠定了基础，但随着疫情期间对快速基因组数据需求的增长，其在可扩展性和测序深度方面的局限性日益显现（Nelson et al., 2014, Xiao et al., 2018）。相反，NGS彻底改变了病毒基因组学，实现了高通量测序，每次运行可产生数百万条读段，从而为病毒遗传多样性和进化轨迹提供了前所未有的洞察（Abdi et al., 2024, Fischer et al., 2015, Zhou et al., 2017）。因此，NGS显著提高了检测病毒变异和混合感染的灵敏度与特异性（Quer et al., 2022, Thorburn et al., 2015, Zhao et al., 2016）。

在当前的测序平台中，Oxford Nanopore Technologies（ONT）因其实时测序能力和较长的读段长度而具有显著优势（Hu et al., 2021, Lu et al., 2016, Oikonomopoulos et al., 2016, Pugh, 2023）。纳米孔测序通过将核酸链穿过纳米孔并转化为离子电流变化来实现核苷酸序列测定。该技术独特的优势在于，一旦获得足够的数据即可终止测序运行，这在需要快速分析的疫情场景中具有重大意义。虽然短读段测序（读段长度约100–300 bp）能够有效支持基因组研究，但通常缺乏对复杂基因组区域（包括重复序列、片段重复、串联重复和复杂结构变异）所需的分辨率。这些局限性导致基因组组装不完整和序列间隙无法解决。长读段测序技术通过产生明显更长的序列读段来缓解这些问题。单分子实时测序通常可产生10–20 kb的高准确度读段，在准确度有所下降的情况下可延伸至数百kb（Jain et al., 2018, Wenger et al., 2019）。尽管A型流感病毒基因组片段相对较短（约0.9–2.4 kb），但长读段方法能够实现全长片段测序并改善单个病毒基因组中突变之间连锁关系的分辨率（Jain et al., 2018, Wang et al., 2015）。纳米孔测序可产生更长读段，长度可达1–2 Mb，尽管这类超长读段通常准确度较低（Deamer et al., 2016, Logsdon et al., 2020, Warburton and Sebra, 2023, Wenger et al., 2019）。现代测序技术集成到病毒学监测中，深化了对流感病毒生物学的理解并支持疫情应对准备工作（Gardy and Loman, 2018, Neher and Bedford, 2018）。

靶向测序策略利用通用设计的引物扩增对应于IAV基因组全部8个片段的所有cDNA序列（Hoffmann et al., 2001）。具体而言，这些引物靶向位于病毒RNA片段末端的高度保守序列。此外，它们在5′端嵌入非流感特异性序列以提高引物退火温度，并便于通过嵌入的限制酶识别位点进行后续克隆。该方法显著增强了IAV基因组的详细分子表征，推动了对病毒传播动态、致病机制和进化过程的基本理解。因此，这种靶向测序方法为基础流感病毒研究和应用性公共卫生工作提供了显著优势（Hoffmann et al., 2001, Zhou et al., 2009）。

本研究旨在解决有效流感病毒分析与进化研究所需的高质量测序数据的关键需求，致力于提升测序工作流程的准确性与速度。我们针对使用人类、猪和禽类IAVs以及ONT长读段测序的全基因组测序，优化了一种RT-PCR方法。我们的方法采用基于简并引物设计的多片段RT-PCR方法，显著提高了基因组覆盖度，并扩增了IAV基因组全部8个片段的完整cDNA序列。为评估优化方法的有效性，我们将其与两种已建立的RT-PCR方法进行了比较，包括使用Superscript III和Uni-12引物的传统两步法（Hoffmann et al., 2001），以及Zhou等人（2009）开发的采用Superscript III及MBT Uni-12和Uni-13引物的标准一步法。该方法显著增加了匹配读段数量，并持续产生更均匀和完整的基因组覆盖，即使对于低投入量的临床样本也是如此。通过减少非特异性扩增、最小化嵌合和无匹配读段，并增强多种宿主物种中的基因组片段表征，该方法能够实现更可靠的少数变异和新兴流感亚型检测，从而显著促进流感监测与应对工作（King et al., 2020, Wang et al., 2015）。

小节片段
样本
我们院内多片段RT-PCR方法（2.4 院内多片段RT-PCR方法，2.5 引物浓度与RT-PCR条件的最终优化，2.6 用于尺寸选择与质量的珠比优化，2.7 传统与优化RT-PCR方法的比较）的开发最初使用三种人H1N1病毒株进行：A/Brisbane/59/2007 (H1N1)、A/Brisbane/10/2009 (H1N1) 和 A/CA/07/2009 (H1N1)。为进一步优化RT-PCR条件，额外引入了一株IAV。

结果
对院内多片段RT-PCR方法进行了系统评估，以在多样的IAV样本面板中实现稳健的扩增、高质量的文库制备以及准确的基因组恢复。实施了关键的方法学优化以增强下游全基因组测序性能、降低背景噪音并最大化全长基因组片段的回收。

讨论
IAVs的持续进化对全球健康构成持续挑战，迫切需要对实时追踪和监测进行改进的基因组工具（Mchardy and Adams, 2009, Bedford et al., 2015）。在本研究中，我们开发并验证了一种院内多片段RT-PCR方法，特别侧重于2-池引物设计（IH-MS2P），专为使用ONT平台进行的全基因组测序定制。我们的结果表明，这种方法显著提高了测序特异性。

结论
在本研究中，我们开发并验证了一种使用Oxford Nanopore Technologies进行A型流感病毒全基因组测序的优化工作流程。IH-MS2P方法在人类、猪和禽类样本中持续实现了高质量的基因组恢复。与传统方法相比，包括传统两步RT-PCR和Zhou等人（2009）的方法，IH-MS2P表现出更优的测序性能，特征为更高的匹配读段比例、更均匀。

伦理声明
本研究遵循以下动物福利和/或报告指南：《实验动物护理与使用指南》第八版。本研究已获奥本大学机构动物护理和使用委员会批准。

CRediT作者贡献声明
Shakiba Kazemian：撰写—审阅与编辑，撰写—原创手稿，可视化，验证，软件，方法学，形式化分析，数据管理，概念构思。Stephen Pedroza：撰写—审阅与编辑，资源，方法学，调查研究，概念构思。Alinne L.R. Santana-Pereira：验证，软件，形式化分析，数据管理。Peter J. Neasham：软件，形式化分析。James F. North：资源。Laura Huber：撰写—审阅与编辑，可视化，指导。

利益冲突声明
作者声明不存在利益冲突。

致谢
本项目获得美国国家过敏与传染病研究所、国立卫生研究院、卫生与公众服务部提供的联邦资金资助（合同编号75N93021C00018，即NIH流感研究与应对卓越中心CEIRR项目），以及美国农业部（USDA）非协助合作协议（6040-32000-081-000D）与奥本大学的合作资助。

Shakiba Kazemian | Stephen Pedroza | Alinne L.R. Santana-Pereira | Peter J. Neasham | James F. North | Laura Huber | Miria F. Criado | Constantinos S. Kyriakis