FXR N端结构域中的一个新型SXXLF基序介导辅调节因子和结构域间相互作用

《ChemBioChem》：A Novel SXXLF Motif in the FXR N-Terminal Domain Mediates Coregulator and Interdomain Interactions

　　

核受体（NR）超家族由配体调控的转录因子组成，其氨基末端含有一个 intrinsically disordered 结构域，称为N端结构域（NTD）。尽管已知这个保守性差的 domain 具有不依赖配体的激活功能（AF-1），但很少有 NTD 功能在 NR 之间保守。在其他受体中已确定的作用包括雄激素受体（AR）、雌激素受体（ER）和盐皮质激素受体（MR）。本研究旨在定义法尼醇X受体（FXR）NTD 的功能，FXR 是脂质和胆汁酸代谢的关键调控因子。研究人员表明，NTD 与 FXR 的其他结构域发生结构域间接触。研究人员还观察到 NTD 直接与辅调节因子蛋白相互作用。通过诱变、哺乳动物双杂交实验、哺乳动物单杂交实验和分子动力学（MD）模拟，研究人员识别并验证了 NTD 中一个新的 SXXLF 基序，该基序介导与辅调节因子和配体结合结构域（LBD）的相互作用。该基序的突变诱导 FXR 构象和变构偶联发生重大变化。本研究识别出一个新的核受体相互作用基序，该基序调节 FXR 的转录活性。

法尼醇X受体（FXR）作为核受体（NR）超家族的成员，在胆汁酸稳态、葡萄糖代谢和脂质代谢等广泛生物学过程中发挥关键调控作用。FXR 具有典型的 NR 模块化结构，包含 N端结构域（NTD）、DNA结合结构域（DBD）、铰链区和配体结合结构域（LBD）。其中 NTD 是一个高度无序的结构域，包含不依赖配体的激活功能（AF-1）区域，但长期以来由于无序性导致的实验困难，FXR NTD 的功能研究一直相对匮乏。已有研究表明其他 NR 的 NTD 参与辅调节因子相互作用和结构域间通讯，例如雄激素受体（AR）中的 FXXLF 和 WXXLF 基序介导 NTD–LBD 相互作用，但 FXR NTD 中是否存在类似的功能基序此前并不清楚。本研究旨在系统定义 FXR NTD 的功能，包括其结构域间相互作用、辅调节因子识别能力，以及介导这些相互作用的特定序列基序。

研究人员围绕 FXRα1 亚型开展了一系列分子和细胞生物学实验。通过构建 NTD 缺失突变体（ΔNTD），利用双荧光素酶报告基因实验系统评估 NTD 对 FXR 转录活性的贡献；采用哺乳动物双杂交（M2H）实验检测 NTD 与 LBD 及其他结构域之间的相互作用；利用哺乳动物单杂交（M1H）实验评估 NTD 独立于其他结构域的转录激活能力；通过对 NTD 序列进行基序分析并结合 AlphaFold 3 结构预测，锁定了一个新型 SXXLF 基序（SENLF），进而通过定点诱变（SENAA）验证其功能。分子动力学（MD）模拟在单体和 FXR-RXR 异二聚体水平上分析了该基序突变对构象动态和变构偶联的影响。研究还利用荧光偏振（FP）肽结合实验定量检测了 SENLF 肽段与 FXR 的结合亲和力。所有报告基因实验均在 HeLa 细胞系（美国典型培养物保藏中心）中进行。

研究结果部分包括以下主要内容。2.1 节研究显示，FXR NTD 与其他 FXR 结构域相互作用：与野生型 FXR（WT-FXR）相比，ΔNTD 突变体在多种配体（CDCA、fexaramine、OCA 和 GW4064）刺激下的转录活性显著下降超过50%，确认 NTD 是 FXR 反式激活的重要贡献者；M2H 实验证实 NTD 与 LBD 直接相互作用，且该相互作用受激动剂调控，而弱激动剂石胆酸（LCA）不能诱导此相互作用；加入 DBD 后进一步增强了 NTD–LBD 的相互作用。2.2 节研究显示，FXR NTD 与 NR 辅调节因子相互作用：M1H 实验表明 GAL4DBD-NTD 单独即具有显著的转录激活能力，且 SRC2 共转染进一步增强该活性，证明 NTD 具有不依赖配体和其他结构域的辅调节因子招募功能；在 M2H 体系中，加入游离 NTD 干扰了单 LXXLL 基序的 SRC1-2 肽段与 LBD 的相互作用，但含有三个 LXXLL 基序的 SRC1-3M 构建不受此干扰，表明多基序的辅调节因子相互作用更强。2.3 节研究显示，FXR-NTD 中发现一个新型 SXXLF 基序介导与 LBD 的相互作用：通过序列分析发现 FXR NTD 中含有 SENLF 序列，与 AR 中已知的 FQNLF 基序相似；AlphaFold 3 预测全长的 FXR 结构显示 NTD 高度无序（平均置信度评分：24.23），但 SENLF 序列（置信度评分：29.48）形成螺旋并停靠在 LBD 的 AF-2 表面附近；将 SENLF 突变为 SENAA 后，在两种报告基因（IR1-luc 和 PLTP-luc）体系中 FXR 转录活性均显著降低，但降低程度不及 ΔNTD 突变体；M2H 实验显示 SENAA 突变降低了 NTD–LBD 的相互作用；荧光偏振实验测得 SENLF 肽段的 EC50 为 32.1 μM，SENAA 突变肽段的 EC50 升高至 42.3 μM，均表明该基序直接参与 LBD 结合。2.4 节研究显示，SXXLF 基序选择性介导 NTD–辅调节因子相互作用：在 WT-FXR 背景下，SRC1、SRC2 和 p300 均增强转录活性；ΔNTD 突变体在 SRC2 和 p300 条件下活性低于 WT-FXR，证实 NTD 与这些辅调节因子发生有效相互作用，但在 SRC1 条件下 ΔNTD 活性反而高于 WT-FXR，提示 NTD 可能干扰 LBD 与 SRC1 的有效互作；SENAA 突变体与 SRC2 的相互作用减弱但活性高于 ΔNTD，与 p300 的作用无显著差异，与 SRC1 的作用呈中间状态；值得注意的是，ΔNTD 与 p300 共转染时活性与无辅调节因子对照相当，提示 FXR 与 p300 的相互作用可能完全由 NTD 介导。2.5 节研究显示，SXXLF 突变影响模拟中的结构域间接触和偶联：单体 FXR 的 MD 模拟（每个模型6个5 μs重复轨迹）中，WT 和 SENAA 突变体的接触图仅有微小差异；在更接近生理状态的 FXR-RXR 异二聚体-DNA 复合物模型（每个复合物4个1.5–3.5 μs重复轨迹）中，接触图显示 NTD 第1–30位氨基酸（包含 SENLF）与 LBD 的 C端区域（包含 H12）在 WT 中发生广泛接触，而在 SENAA 突变体中这些接触消失；轨迹聚类分析显示，WT 中 SENLF 基序始终位于 H12 约20 ? 半径范围内，而 SENAA 突变体中该片段可远离至约40 ?；特定氨基酸对 G27-Q313（NTD-H4）的距离从 WT 的18.7 ? 增至突变体的37.2 ?，V43-F282（NTD-H3）的距离从40.8 ? 降至19.8 ?，表明突变诱导了显著的构象重排；相关性矩阵分析显示，SENAA 突变体中 NTD 第1–30位残基与整个 LBD 呈反相关，而 WT 中多个区域（包括 H10 至 H12）呈正相关，说明该基序突变显著改变了 NTD 与 LBD 之间的变构偶联模式。

讨论部分指出，FXR-NTD 通过 SENLF 基序参与结构域间相互作用和辅调节因子识别。SXXLF 代表一种新型的 NR 识别基序，此前 AR 中的 WXXLF 和 FXXLF 首次揭示了 NR 中的非经典 LXXLL 辅调节因子基序，SENLF 的发现拓展了这一类别。SENLF 基序不能完全解释 NTD 的全部功能贡献，因为 SENAA 突变体的活性降低程度不及 ΔNTD，说明 NTD 中其他区域也参与关键功能。此外，FXRα3 和 FXRα4 亚型的延长 NTD 序列中不包含 SENLF 基序，提示不同亚型可能利用不同的机制执行这些功能。研究还观察到辅调节因子对 NTD 和 LBD 的偏好不同：p300 的招募可能完全依赖 NTD，而 SRC1 可能更偏好 LBD 相互作用，核心调节因子在不同结构域之间的分配机制有待未来研究。

研究结论部分：综上所述，本研究确认了 FXR-NTD 的两个作用：与 LBD 的相互作用以及对辅调节因子的识别。SENLF 基序是 FXR-NTD 中首个被定义的功能元件，介导 NTD–LBD 相互作用和选择性辅激活因子结合，从而驱动 NTD 介导的转录活性。本研究发表于《ChemBioChem》。