N8-修饰的喹诺[4,3,2-kl]吖啶类化合物作为有前景的抗疟G-四链体配体

《ChemBioChem》：N8-Modified Quino[4,3,2-Kl]acridines as Promising Antimalarial G-Quadruplex Ligands

　　

为了应对疟原虫恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）日益严重的多药耐药性，开发以新方式发挥作用的新化合物迫在眉睫。G-四链体（G-quadruplexes，G4）是DNA和RNA序列的富鸟嘌呤二级结构，在细胞存活和细胞代谢调控中发挥重要作用，包括在疟原虫中。研究人员最近证明，G-四链体配体RHPS4（一种吖啶衍生物）通过稳定G4来破坏恶性疟原虫，导致寄生虫死亡，从而表现出强效抗疟活性。基于这种原创作用机制，研究人员在此提出了一系列新的RHPS4类似物。随后，研究人员对这些衍生物进行了针对恶性疟原虫和人细胞的测试，以评估其选择性指数。它们表现出从70 nM到10 μM不等的IC₅₀值，其中阳离子类似物比中性类似物更活跃。还评估了它们与G-四链体DNA结构相互作用并稳定其的能力。在所有RHPS4类似物中，化合物8b（N8-乙基）表现出最佳活性（70 nM）、高选择性指数（143）以及显著的稳定G4结构的能力。

N8-修饰的喹诺[4,3,2-kl]吖啶类化合物作为抗疟G-四链体配体的研究解读

**一、研究背景与目的**

疟疾仍是全球严重的健康威胁。尽管2000年至2015年疟疾发病率有所下降，但自2015年起病例数增加了23%，估计2024年导致61万人死亡。青蒿素联合疗法（artemisinin combination therapies，ACTs）的核心药物青蒿素耐药性首先在东南亚报道，随后在大湄公河次区域导致ACTs失败，现已在南美出现并在非洲蔓延，而非洲占疟疾死亡人数的95%，其中75%为5岁以下儿童。因此，亟需开发对多药耐药疟原虫仍有效且作用机制新颖的抗疟药物。

G-四链体（G-quadruplex，G4）是由富含鸟嘌呤的DNA或RNA序列折叠形成的四链非经典二级结构，在细胞存活和代谢调控中具有重要作用。虽然恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）基因组AT含量极高（>80%），但仍能形成G4结构，且线粒体基因组中G4基序密度高于核基因组。研究人员前期发现，G4配体RHPS4（一种基于8H-喹诺[4,3,2-kl]吖啶骨架的吖啶衍生物）对恶性疟原虫具有强效体外活性（IC₅₀值26–90 nM），包括对多药耐药株，且对寄生虫的选择性高于人细胞（选择性指数SI为100–300）。RHPS4还能降低寄生虫线粒体DNA拷贝数，提示其可能通过靶向疟原虫线粒体G4发挥抗疟作用。基于这一原创机制，研究人员设计并合成了一系列RHPS4类似物，旨在提高对疟原虫G4的亲和力，进而增强抗疟活性和选择性。

**二、研究内容与意义**

研究人员采用多步合成方法对RHPS4骨架进行修饰，在N8位引入不同取代基，获得一系列中性或阳离子衍生物，并系统评价了其抗疟活性、细胞毒性和G4结合能力。研究发现，化合物8b（N8-乙基）表现最佳：IC₅₀为70 nM，选择性指数为143，且能显著稳定G4结构。该研究为开发具有新作用机制的抗疟药物候选物提供了有前景的化学系列，论文发表于《ChemBioChem》。

**三、关键技术方法**

研究人员利用多步合成方法构建喹诺[4,3,2-kl]吖啶骨架，包括钯催化邻位溴化、Suzuki–Miyaura偶联、亲核芳香取代、阴离子环化及N13季铵化等步骤。使用核磁共振（NMR）和单晶X射线衍射确认结构，紫外-可见光谱测定pKa值。生物学评价中，采用SYBR Green I法测定化合物对恶性疟原虫F32-Tanzania株的抗疟活性，磺酰罗丹明B（SRB）法评估人肝癌细胞HepG2的细胞毒性，荧光共振能量转移（FRET）熔解实验检测对G4 DNA的稳定能力及对双链DNA的选择性。

**四、研究结果**

**2 合成与表征**

通过多步反应合成了N8位不同取代的衍生物，包括中性化合物7a–e、7h，季铵化化合物8b、8d、8e，以及含伯醇（11）、二胺（12）和三苯基膦（13）的衍生物。X射线衍射确认了结构，并揭示N13正电荷导致吖啶鎓化合物8相比中性化合物7具有更大的骨架扭曲：二面角从18°至26°，而中性化合物小于5.3°。pKa测定显示化合物7b的pKa为3.7，生理pH下主要呈中性。

**3 抗疟活性和细胞毒性**

抗疟活性测试显示，RHPS4对F32-Tanzania株的IC₅₀为63 nM。阳离子类似物8b、8d、8e保留显著活性（IC₅₀ 70–369 nM），而中性类似物7a、7b、7d、7e完全无活性（IC₅₀ >10 μM）。含质子化二胺侧链的化合物12活性中等（IC₅₀ 430 nM），三苯基膦化合物13活性更低（IC₅₀ 1007 nM）。所有化合物对HepG2细胞毒性较低（CC₅₀ 4–121 μM），RHPS4和8b的选择性指数分别为111和143。

**4 RHPS4衍生物与G4结构的结合**

FRET熔解实验采用F21T人端粒G4序列。RHPS4使T_1/2升高16.4 °C，8b和8e分别升高12.6 °C和9.4 °C，而中性化合物无显著稳定作用，表明N13正电荷对G4结合至关重要。竞争实验显示，在50倍摩尔过量双链寡核苷酸ds26存在下，RHPS4、8b、8e对F21T的稳定作用不变，证明其对G4具有选择性。

**五、讨论与结论**

讨论指出，N8位取代基可调节活性，但N13正电荷虽对抗疟活性必需却非充分条件。例如，阳离子化合物8d具有抗疟活性（IC₅₀ 180 nM）却不显著稳定F21T，说明G4稳定能力与抗疟活性并非严格相关。结论部分翻译如下：研究人员合成了一系列RHPS4衍生物，该多步方法可对8H-喹诺[4,3,2-kl]吖啶骨架进行多种取代。仅带N13正电荷的化合物（RHPS4、8b、8d、8e及12）表现出高抗疟活性（IC₅₀ <500 nM），而中性对应物无活性。RHPS4和8b具有最高活性（IC₅₀分别为63和70 nM）、最高选择性指数（111和143）及最高的F21T热稳定化（ΔT_1/2分别为16.4 °C和12.6 °C），且对双链DNA具有选择性。这些结果表明，在此系列中N13正电荷对高效抗疟活性和选择性是必需的，但并非充分，可能与其与G4 DNA结构的相互作用有关。因此，该化学系列成为具有新机制的抗疟药物候选物的有前景方向。