通过TrkB激活诱导轴突生长的从头设计肽

《ChemBioChem》：A De Novo Peptide That Induces Axonal Growth Through TrkB Activation

　　

脑源性神经营养因子（BDNF）及其受体原肌球蛋白相关激酶B（TrkB）是神经元存活与突触可塑性的关键调节因子。BDNF–TrkB信号受损与阿尔茨海默病和重度抑郁症等神经退行性与神经精神疾病密切相关。然而BDNF因药代动力学差和组织稳定性低而临床应用受限，因此亟需替代性TrkB激动剂。既往许多激动剂存在TrkB激活不一致或间接激活问题，其作用机制受到质疑。研究人员采用随机非标准肽集成发现（RaPID）系统，鉴定可高亲和力、高选择性结合TrkB胞外域的从头大环肽配体。其中一个肽被改造为二聚肽diTrbL3，其可诱导TrkB自磷酸化并激活ERK1/2和AKT等经典下游通路，且未检测到对其他受体酪氨酸激酶的交叉激活。功能上，diTrbL3促进原代海马神经元轴突延长，并上调活动依赖性即早基因。这些结果表明diTrbL3是一种强效从头TrkB激动剂，并证明RaPID来源大环肽可作为靶向TrkB依赖信号、用于神经系统疾病的BDNF模拟物。

论文解读：《ChemBioChem》发表的该项研究以BDNF–TrkB通路为对象。研究背景方面，BDNF作为神经营养因子家族成员，可结合TrkB与p75神经营养素受体，其中对TrkB亲和力至少高10倍。TrkB为跨膜酪氨酸激酶，BDNF结合后发生近胞质C端酪氨酸自磷酸化，激活磷脂酶C-γ（PLCγ）、磷酯酰肌醇3-激酶（PI3K）和MEK-ERK三条主要下游通路，参与突触可塑性、神经元存活与轴突生长。BDNF在肌萎缩侧索硬化、帕金森病、阿尔茨海默病模型中具神经保护潜力，但重组BDNF体内半衰期短、临床转化失败；同时BDNF结合p75可启动死亡通路，剂量控制困难。已有小分子如7,8-二羟基黄酮（7,8-DHF）、LM22A-4、去氧基古杜宁等被报道为TrkB激动剂，但独立研究未能重复其直接TrkB自磷酸化作用，机制存疑；抗体类与含Lys-Lys-Arg（KKR）基序环肽也分别存在种属反应弱或抑制BDNF–TrkB结合、选择性不清的问题。因此研究人员开展本研究，旨在用RaPID平台获得高亲和、高选择、可真正激活TrkB的BDNF模拟物。

主要关键技术方法如下：研究人员使用随机非标准肽集成发现（RaPID）系统，依托柔性体外翻译（FIT）系统与flexizyme介导的遗传密码重编程，构建硫醚大环肽库并以其mRNA–肽融合体进行基因型表型偶联筛选；采用表面等离子共振（SPR）定量结合动力学；以原代小鼠海马神经元与原代皮质神经元为细胞模型；用Western blotting检测磷酸化Trk、AKT、ERK1/2；用磷酸化受体酪氨酸激酶（RTK）阵列评估40种RTK脱靶情况；用实时定量转录分析检测即早基因；用免疫荧光与NeuronJ量化轴突生长。

研究结果部分保留小标题说明。2.1 RaPID Selection Against hTrkB Discovers Potent Peptide Binders：研究人员以Ni-NTA磁珠固定His标签人TrkB胞外域，进行5轮筛选，测序取丰度最高TrbL1–3与TrbD1–3单体。SPR显示所有肽对hTrkB解离常数（K_D）为1.5–70 nM，TrbL1、TrbL3、TrbD2不结合TrkA/TrkC，其中TrbL3 K_D为1.5 nM且选择性最佳。

2.2 Dimerization of Peptides Retains the Potency of Their Binding to hTrkB：研究人员用PEG5–DAP–PEG5连接臂将单体转为同源二聚大环肽diTrbL1–3与diTrbD1–3。SPR表明二聚体对hTrkB亲和力与单体相近，但部分二聚体丧失选择性；diTrbL3仍只结合hTrkB，不结合hTrkA与hTrkC。

2.3 An Artificial Dimeric Peptide Potently Induced Phosphorylation of TrkB：在原代小鼠海马神经元中，1 nM各二聚肽处理15 min，仅diTrbL3诱导TrkB磷酸化；0.1 nM BDNF为阳性对照。TrkB激酶域抑制剂ANA-12可消除该磷酸化，0.2 nM diTrbL3即显著激活，证明其为跨小鼠与人物种的特异性TrkB磷酸化激动剂。

2.4 DiTrbL3 Peptide Is a Specific TrkB Agonist：diTrbL3 1 nM处理激活AKT（S473磷酸化）与ERK1/2，ANA-12抑制该效应。磷酸化RTK阵列中含40种RTK，diTrbL3仅磷酸化TrkB，与BDNF谱一致，证明细胞水平高特异性。

2.5 DiTrbL3 Treatment Induces Neuronal Gene Activation and Enhances Axonal Outgrowth：原代皮质神经元经1 nM diTrbL3处理1 h，c-fos与Arc表达显著升高。原代海马神经元从DIV0至DIV3用diTrbL3处理，10 nM与100 nM显著促进Tau阳性、MAP2阴性轴突延长，效果类似BDNF。

讨论部分总结：研究人员指出，相较机制受质疑的小分子，RaPID所得大环肽具抗体级亲和力与种属交叉反应，diTrbL3可成为小鼠模型研究BDNF–TrkB通路的有用工具。其局限在于细胞穿透性差、需跨越血脑屏障（BBB），因TrkB为胞外靶点且diTrbL3亚纳摩尔起效，仍须递送策略方可推进中枢神经系统疾病治疗。该工作也将化学诱导二聚策略扩展至更多膜受体治疗领域。

结论部分翻译：本研究报道了人TrkB从头大环肽结合物的发现。这些大环肽经柔性PEG连接臂转化为同源二聚体，可模拟TrkB天然激动剂BDNF。六种结合hTrkB胞外域的同源二聚大环肽中，diTrbL3可在小鼠神经元通过TrkB自磷酸化激活下游信号，表现出强效且特异的小鼠TrkB激动作用，并诱导神经元基因激活与轴突生长增强。因此diTrbL3可作为神经与精神疾病治疗候选的重要先导物。然而与小分子中枢药物类似，diTrbL3面临细胞渗透性差与跨血脑屏障（BBB）挑战；虽TrkB为胞外靶点且diTrbL3亚纳摩尔即有效，仍须有效递送策略才能推进为中枢神经系统疾病治疗候选。此外，结果进一步验证同源二聚肽可替代天然蛋白配体诱导细胞表面受体二聚，将化学诱导二聚概念拓展至其他治疗领域。