《Conservation Science and Practice》：Environmental DNA succeeds in detecting a low-density population of endangered harlequin frogs
编辑推荐：
新热带丑角蟾属（Atelopus）是受种群衰退和灭绝影响最严重的类群之一。环境DNA（eDNA）提供了一种有价值、非侵入性的工具，用于检测低密度和难以发现的物种。研究人员评估了其在厄瓜多尔安加马卡（Angamarca）——该物种唯一已知分布地——跨季节和栖息地
新热带丑角蟾属（Atelopus）是受种群衰退和灭绝影响最严重的类群之一。环境DNA（eDNA）提供了一种有价值、非侵入性的工具，用于检测低密度和难以发现的物种。研究人员评估了其在厄瓜多尔安加马卡（Angamarca）——该物种唯一已知分布地——跨季节和栖息地检测最近被重新发现的极度濒危Jambato丑角蟾（Atelopus ignescens）的有效性；在为期一年的密集月度调查后，该地仅记录到71个个体（包括6只蝌蚪）。研究人员在雨季和旱季从14个地点收集了18份水样，包括河流、溪流和成虫使用的灌溉渠。eDNA宏条形码分析在18份样本中的5份中检测到该物种，且全部来自雨季。大多数检测（n = 4）来自河流，主要集中在雨季末期（5月初），其中三次来自此前观察到蝌蚪的唯一河流。其余检测来自退化最轻微的地点和灌溉渠。研究结果突显了eDNA在繁殖期和蝌蚪栖息地检测A. ignescens的价值。该研究强调了eDNA为监测和保护策略提供信息的潜力，并强调了保护较少受干扰栖息地以确保极度濒危物种生存的重要性。
**研究背景与问题**
人类活动已引发环境危机，两栖动物正处在第六次大灭绝的前沿。新热带丑角蟾属（Atelopus）是受种群衰退和灭绝冲击最严重的单一类群，其超过100个物种中80%以上面临灭绝威胁，主要驱动因素包括栖息地破坏与退化、壶菌Batrachochytrium dendrobatidis感染和气候变化。Jambato丑角蟾（Atelopus ignescens）曾广泛分布于厄瓜多尔中北部安第斯山间谷地和帕拉莫（páramo）生态系统，但在1988年后从所有已知分布点消失，曾被宣布为厄瓜多尔首个灭绝的无尾目物种。2016年，该物种在安加马卡（Angamarca）被重新发现。此后的持续监测显示，该地是A. ignescens唯一已知的种群所在地，但经过一年每月密集调查仅记录到71个个体（包括32只雄性、31只雌性、2只幼体和6只蝌蚪），且种群遗传变异极低（平均杂合度0.1951），低于衰退前样本（0.2445）。由于该物种成体和蝌蚪均极难发现，传统主动搜索效率有限，亟需更敏感的非侵入性检测工具。环境DNA（environmental DNA, eDNA）宏条形码技术已被证明在某些条件下比主动搜索更灵敏、更高效，因此本研究旨在评估eDNA检测A. ignescens的有效性，并确定其在不同栖息地、季节和发育阶段中的可检测性，具体回答三个问题：能否用eDNA检测到该物种？哪些栖息地可检测到？哪个季节可检测到？
**研究内容与方法**
研究区域位于厄瓜多尔中部科托帕希省安加马卡教区，瓜拜内河流域（Guambaine River Basin），海拔1600–4500米。研究人员根据前一年调查中对成体与蝌蚪栖息地分布的认识，于2022年雨季（2月和5月）及旱季末（11月）在14个采样点采集18份1升水样，覆盖灌溉渠（水渠和池塘）、三条河流（瓜拜内河、萨里波-瓜拜内交汇处、托雷河）和三条溪流（基拉洛溪、安加马卡河小支流、圣巴勃罗溪），其中4个关键位点在雨季和旱季均采样。水样经3 μm和0.45 μm滤膜分级过滤后，使用DNeasy PowerWater Kit提取DNA。研究人员基于10种Atelopus物种的12S rRNA基因序列设计特异性引物对（12S_eDNA_Atelo_F2/R2），扩增产物244 bp，并在11种Atelopus活体水样的阳性对照中验证了其有效性。随后采用两步PCR构建宏条形码文库，基于Illumina MiSeq平台进行2×250 bp双端测序。生物信息学分析使用DADA2进行去噪并划分扩增子序列变异（ASV），通过自定义BLAST数据库（包含本研究测序的10种Atelopus及NCBI下载序列）进行比对，以1e?40的e值阈值和97%的最低相似度进行物种注释，并剔除阴性对照中出现的ASV，以67条读长作为保守的保留阈值。
**主要结果**
测序共获得8,915,666条原始读长，经质控后得到27,988个ASV。在18份环境样本中，5份检测到Atelopus属的12S序列，共18个独特ASV，阳性检出率为27.8%。所有阳性检测均出现在雨季，其中4份来自河流样本（河流样本阳性率36.4%），且主要集中于雨季末期（5月初）；瓜拜内河6份样本中3份阳性，包括此前发现蝌蚪的位点；最不退化位点萨里波-瓜拜内交汇处（SR）在5月的样本也呈阳性；灌溉渠3份样本中1份阳性（33.3%）。旱季采样的样本全部为阴性。虽然ASV比对到包括A. bomolochos、A. flavescens、A. chiriquiensis、A. ignescens和A. nanay的多个物种，但由于安加马卡流域已知仅分布A. ignescens一种Atelopus，因此所有检测均可归结为该物种。
**讨论与结论**
研究发现eDNA阳性信号几乎全部在雨季末期的较大河流中检出，旱季无检出，表明蝌蚪在雨季末期数量增加，显著提高了环境中遗传物质的沉积量，从而增强eDNA可检测性；同时，雨季更高的流量和湍流并未冲淡或洗脱DNA，反而因繁殖活动增加了信号。研究结果支持eDNA主要反映蝌蚪的存在而非成体：尽管灌溉渠中记录到大量成年个体（包括临时浅水塘边直接观察到成体），但该处样本多为阴性，可能因浅层地表水中eDNA降解迅速；溪流样本也全为阴性，且其中两份采自旱季、一份采样点上游2米处有怀卵雌体，但仍未检出。这表明繁殖活动和蝌蚪栖息地（河流）是eDNA检出的主要来源，而成体栖息的陆域环境（农田、灌木、帕拉莫等）并非有效采样对象。研究还指出，使用3 μm预滤膜可能截留部分eDNA颗粒，造成阳性检出率偏低，未来应优化预滤孔径、增大过滤体积，并采用更严格的消毒程序（如50%漂白剂、紫外暴露）。研究人员强调，eDNA是传统调查的重要补充工具，能够确认该极低密度种群的持续繁殖；但保护不能仅局限于繁殖水体，还需保护成体迁移所利用的陆域栖息地和廊道。萨里波-瓜拜内交汇处等相对完整且适宜蝌蚪发育的关键区域应优先保护，但该地点近期已受道路建设和野火干扰，需持续监测。最终结论是：eDNA能够有效检测A. ignescens，并应在物种历史分布区和姊妹种A. sp. (aff. ignescens-guanujo)最后记录点开展大规模eDNA调查，以发现新种群、增加遗传多样性和种群规模，为制定主动、整合性的保护策略提供关键信息，确保这一标志性物种的长期生存。
