癌症治疗改变正常食管的突变选择

《Nature Genetics》：Cancer treatment alters mutant selection in normal esophagus

　　

衰老的上皮组织，包括食管，在强烈的竞争性选择下被体细胞突变克隆（somatic mutant clones）定植。癌症治疗对正常上皮中突变选择的影响尚不清楚。研究人员假设某些突变克隆可能在治疗过程中被选择性扩增。为验证这一假设，研究人员对70例食管癌患者治疗后切除的正常食管上皮进行了测序。患者要么未接受治疗，要么接受联合化疗（FLOT、ECX或EOX方案），要么接受化疗联合放疗（CROSS方案）。在接受CROSS方案的患者中，突变型TP53和PPM1D克隆发生扩增。在接受FLOT方案的患者中，RAC1、NFE2L2和MTOR突变的选擇增强，这与这些突变赋予正常上皮5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil, 5-FU）耐受性一致。对正常上皮的测序揭示了治疗特异性突变选择，并可能鉴定参与细胞对治疗反应的基因。

论文解读

**研究背景与问题**

正常食管上皮是由突变克隆构成的动态嵌合体组织，突变特征分析显示其突变源于细胞内在过程以及部分个体的酒精和烟草暴露。具有适应性优势的突变克隆不断扩增、碰撞并竞争组织空间，只有最具适应性的突变才能存活。癌症治疗可能驱动正常组织中突变克隆的选择性扩增，例如在造血系统中，经放疗、铂类药物或TOP2A抑制剂治疗的患者会出现CHEK2、PPM1D和TP53突变克隆，但癌症治疗对正常食管上皮突变选择的影响此前未知。食管癌主要有鳞状细胞癌（squamous cell carcinoma, SCC）和腺癌两种类型，治疗方式包括单纯手术或新辅助治疗（化疗或放化疗）后手术。新辅助化疗方案包括FLOT、EOX、ECX，CROSS方案则为放疗联合紫杉醇和卡铂。研究人员假设抗癌治疗可能改变已高度突变的正常食管中突变克隆的选择，并利用治疗切除标本中的正常食管组织检验这一假设。

**研究人员开展的研究与结论**

研究人员收集了70例食管癌患者手术切除的正常食管组织，其中21例未接受治疗（NT），17例接受ECX，14例接受EOX，7例接受FLOT，11例接受CROSS方案。利用纳米速率测序（NanoSeq）、靶向测序和全基因组测序（whole-genome sequencing, WGS）分析正常食管上皮的突变景观。结果发现，CROSS方案使TP53和PPM1D突变克隆显著扩增，而FLOT方案增强了RAC1、NFE2L2和MTOR突变的选择。这些发现表明不同治疗以突变特异性方式重塑正常组织的克隆结构，为理解治疗相关耐药和正常组织毒性提供了新视角。该研究发表在《Nature Genetics》。

**主要关键技术方法**

研究样本来自意大利米兰San Raffaele研究医院和英国南安普顿综合医院。关键技术包括：NanoSeq双链测序检测多克隆样本中的体细胞突变；对1995个2-mm²样本进行324个癌症相关基因的靶向测序；对37个克隆性微样本进行WGS；dN/dS比值分析评估正选择；一维非随机突变聚类（NMC）和三维结构建模分析突变空间分布；CRISPR–Cas9编辑小鼠食管类上皮培养物验证辐射对PPM1D突变的选择作用；分子动力学模拟分析RAC1突变对蛋白构象的影响。

**研究结果**

**治疗后食管的突变负荷与突变特征**：NanoSeq分析显示NT、EOX、ECX和FLOT组的突变负荷与无癌症的年龄匹配患者相当，但CROSS组突变负荷显著升高。从头突变特征分析识别出SBS288A和SBS288B两种特征，未检测到5-FU、奥沙利铂或卡铂相关的化疗突变特征（SBS25、SBS31和SBS35）。CROSS患者的插入缺失（indel）负荷，特别是缺失，显著升高，与电离辐射暴露一致。

**突变克隆的选擇**：对1995个2-mm²样本进行靶向测序，共鉴定23,692个独立突变。各组的突变密度、类型和突变特征比例相似，表明大多数突变克隆在治疗前已存在，组间差异反映不同治疗下突变选择的变化。dN/dS比值分析显示TP53、PPM1D、NOTCH1、NOTCH2和FAT1在所有组均受正选择。

**CROSS患者中TP53和PPM1D突变克隆扩增**：CROSS患者中TP53和PPM1D突变上皮比例是其他组的两倍，突变克隆大小也显著增大。CRISPR–Cas9实验证实，与5-FU或未处理相比，辐射选择性扩增携带截短型功能获得性（gain of function, GOF）PPM1D突变的上皮克隆。CROSS患者中TP53基因座所在的17p染色体拷贝数改变（copy number alteration, CNA）事件显著增多，WGS证实部分克隆存在TP53双等位基因失活。

**HLA-B和SPOP突变仅在CROSS患者中被选择**：HLA-B在CROSS组受正选择，59%的HLA-B非同义突变为移码、剪接或无义突变，且6p染色体HLA基因座CNA事件在8.7%的CROSS样本中出现。SPOP突变仅在CROSS组富集，三维结构分析提示这些突变与配体结合能量改变相关，可能为功能缺失（loss of function, LOF）突变。

**FLOT增强突变选择**：NFE2L2、RAC1和MTOR仅在FLOT组受正选择。NFE2L2突变集中在KEAP1结合域（DLG和ETGE基序），提示GOF突变被选择。RAC1突变位于Switch结构域铰链区，分子动力学模拟显示这些突变增加蛋白柔性和GTP结合亲和力。MTOR突变富集于激酶结构域，与已知激活突变重叠，且携带激酶结构域突变的克隆更大。FLOT组中MTOR突变不影响雷帕霉素结合，提示这些克隆可能仍对雷帕霉素类似物敏感。

**讨论与结论**

该研究表明，经过数十年演化的正常上皮突变景观可在数周的抗癌治疗选择性压力下发生显著改变，导致预先存在的突变克隆选择性扩增。CROSS方案使TP53和PPM1D突变上皮面积翻倍，并伴随TP53位点CNA，这可能是食管辐射暴露后癌症风险增加的潜在机制。FLOT方案选择MTOR、RAC1和NFE2L2的激活突变，这些突变可能赋予正常食管细胞对5-FU的耐受性。研究局限包括每组患者数量较少及未能检测负选择。对正常组织测序可揭示多种癌症治疗后的突变选择改变，为减轻正常组织毒性提供潜在靶点，并可为克服肿瘤耐药策略提供参考。