基于调制型表面等离子体共振传感器的黄曲霉毒素快速检测

《Measurement: Food》：Rapid Aflatoxin Detection Based on Modulated Surface Plasmon Resonance Sensor

　　

摘要：研究人员提出了一种基于35 nm金薄膜、工作在635 nm、采用Kretschmann-Raether构型的调制型表面等离子体共振（SPR）传感器，用于黄曲霉毒素B1、G1和G2的无标记检测与定量分析。研究人员通过锁相放大引入相位敏感检测，以抑制低频噪声并提高测量稳定性。该传感器表现出清晰且可重复的角度响应，在1 ppm浓度下，AFG1、AFB1和AFG2的共振角偏移分别为1.417°、0.607°和0.303°，对应的仪器检测限分别为0.06、0.14和0.28 ppm。在532 nm绿激光照射下进行的时间分辨测量显示出一级界面动力学特征（R2≈0.98），证明该平台具有动态监测能力。与依赖抗体或适配体的传统SPR生物传感器相比，所提出的传感器无需生物识别层即可直接区分结构相似.的黄曲霉毒素类似物，简化了传感器制造工艺，同时为食品安全监测提供了快速、可重复且定量的检测手段。

黄曲霉毒素（Aflatoxins）是由黄曲霉（Aspergillus flavus）和寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）等丝状真菌产生的一类具有强毒性和致癌性的次级代谢产物。在已发现的多种类似物中，黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2是食品及饲料中最常检出且受法规重点监控的品种。国际癌症研究机构（IARC）基于流行病学和机制学证据，已将黄曲霉毒素—特别是黄曲霉毒素B1（AFB1）—列为第一类致癌物，因其与肝细胞癌的发生存在因果关系。其毒性源于代谢激活后形成的高活性环氧化物中间体，这些中间体可与DNA和蛋白质形成稳定的加合物，进而导致致突变、免疫抑制和生长发育受损。黄曲霉毒素广泛污染谷物、坚果、香料和干果，尤其在温暖潮湿的储存条件下污染更为严重，不仅构成持续性的食品安全隐患，还因货物拒收和贸易限制造成重大经济损失。此外，黄曲霉毒素M1作为AFB1在牲畜体内的羟基化产物，可排泄进入乳及乳制品中，扩大膳食暴露途径，增加消费者健康风险。

当前黄曲霉毒素的检测方法主要分为色谱法、免疫化学法和传感器法三大类。高效液相色谱（HPLC）和液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）因其准确性、选择性和多毒素同步定量能力而被视为参考方法，可在复杂食品基质中将黄曲霉毒素检出限降至ng/kg量级。然而，这些技术依赖昂贵仪器、专业人员操作和繁琐的样品前处理，不适合快速现场筛查。免疫化学方法如酶联免疫吸附试验（ELISA）和侧向流免疫层析法（LFIA）因操作简便、分析快速和成本较低而被广泛用于常规筛查，但抗体稳定性差、交叉反应和基质干扰等问题仍可能影响分析可靠性，通常需要色谱方法确证。

近年来，基于传感器的检测技术结合了高分析灵敏度与便携性、快速性的优势而备受关注。其中，基于表面等离子体共振（SPR）和局域表面等离子体共振（LSPR）的光学等离子体传感技术，利用金属纳米结构中传导电子的集体振荡产生增强电磁场，可实现无标记、实时、高灵敏检测，在食品安全监测中极具应用前景。已有研究采用分子印迹聚合物（MIP）薄膜修饰金纳米颗粒的SPR纳米传感器，在玉米和花生样品中实现低pg/mL量级的AFB1检出限；SPR免疫传感器芯片可同时测定包括AFB1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮和脱氧雪腐镰刀菌烯醇在内的多种真菌毒素；LSPR平台结合全内反射椭偏术可实现AFB1和AFM1的无标记适配体检测；双金属铜-银纳米结构也被用于快速无纸等离子体传感。这些研究表明等离子体传感在食品安全应用中具有高灵敏度和多用途性。然而，对于小分子黄曲霉毒素，现有高灵敏度方案通常依赖适配体或分子印迹聚合物等选择性识别层，这需要额外的表面修饰、固定化条件优化和界面化学控制，增加了制造复杂性并可能影响传感重现性。因此，开发无需复杂识别层即可检测结构相近小分子的简化等离子体传感平台，仍是重要的研究方向。此外，在光信号采集方面，外部调制和相位敏感检测技术通过抑制低频噪声和最小化基线漂移，已被证明可增强测量稳定性和灵敏度。锁相放大能够在特定调制频率下选择性提取微弱光信号，显著改善信噪比，特别适用于直接传感平台中由分析物吸附引起的微小折射率变化测量。

针对上述问题，研究人员引入了一种结合锁相放大的调制型SPR传感平台，用于黄曲霉毒素B1、G1和G2的直接检测，无需抗体、适配体或分子印迹识别层。该传感器采用Kretschmann构型中的裸35 nm金薄膜，黄曲霉毒素分子直接吸附产生界面介电环境变化，从而引起可测量的共振角偏移。通过将简化的传感界面与相位敏感信号恢复相结合，平台在保持简洁传感器结构的同时提高信噪比，实现快速、无标记的黄曲霉毒素检测。该研究发表于《Measurement: Food》。

研究人员在开展研究时主要采用了以下关键技术方法：基于Kretschmann-Raether构型的自建角度扫描SPR系统，以635 nm p偏振激光作为激发光源，利用步进电机和皮带-滑轮传动系统实现高精度角度扫描；采用3.62 kHz正弦调制激光强度，并通过Moku:Go锁相放大器进行相位敏感解调，以抑制低频噪声并提高信噪比；通过磁控溅射制备5 nm铂黏附层/35 nm金薄膜SPR传感芯片；采用旋涂法将黄曲霉毒素标准溶液均匀沉积于金膜表面，测定干燥后的共振角偏移以计算灵敏度与检测限；在532 nm绿激光照射下对AFG1涂覆基底进行时间分辨SPR测量，监测共振角与反射率的动态变化并拟合动力学模型。黄曲霉毒素B1、G1和G2标准品（纯度≥98%）购自Sigma-Aldrich。

在结果与讨论部分，研究人员首先测定了AFG1、AFG2和AFB1的SPR光谱。结果表明，裸金表面共振角约为45.349°，暴露于1 ppm黄曲霉毒素后，AFG2偏移至45.652°，AFB1偏移至45.956°，AFG1偏移至46.766°，呈现系统性的规律偏移，表明分析物吸附导致传感界面有效折射率增加。归一化反射率谱显示不同分析物在凹陷深度和谱线展宽上存在差异，其中AFG1表现出更宽且略浅的共振凹陷，归因于更强的等离子体阻尼和增强的界面相互作用。在约44°至46°的角度区间内，传感器具有最高灵敏度。

随后，研究人员通过信噪比方法估算了仪器检测限。基于空白响应标准偏差σ=0.02840°和1 ppm浓度下AFG1的灵敏度S=1.417° ppm?1，计算得到LOD=3σ/S=0.061 ppm。进一步分析显示，AFG1具有最低检出限（0.06012 ppm），其次为AFB1（0.14034 ppm），AFG2检出限最高（0.28114 ppm）。对应的共振角偏移遵循相同的趋势，AFG1产生最大角度位移（1.417°），其次为AFB1（0.607°）和AFG2（0.303°）。共振偏移与检出限之间的强相关性表明，传感器性能主要由分子吸附引起的等离子体扰动幅度决定。研究人员还比较了三种黄曲霉毒素的响应特性，包括共振角、角偏移、半高全宽（FWHM）和相对响应因子，其中AFG1的相对响应因子最高（4.68）。这些差异归因于分子吸附、等离子体近场增强和界面局部介电极化变化的综合作用。结构差异包括取代基变化和环饱和度的不同，影响了分子在金表面的吸附亲和力、表面覆盖率和吸附层组织方式，进而决定了界面有效折射率变化的大小和SPR共振角偏移的幅度。

为评估平台的动态响应能力，研究人员选择AFG1作为代表分析物，在532 nm绿激光（10 mW/cm2）照射下进行了30分钟的时间分辨研究。结果显示，随着照射时间增加，SPR凹陷逐渐向更高角度偏移，从5分钟时的约0.101°增加到30分钟时的0.607°。归一化SPR谱在照射约20分钟后出现共振凹陷的逐渐展宽和畸变，可能表明吸附分子层内光学损耗增加和异质性增强。对照组样品在整个实验期间保持稳定，确认观察到的变化源于受控光学照射而非仪器漂移或环境波动。时间分辨SPR信号强度随辐照时间呈连续下降趋势，拟合曲线符合单指数衰减模型，拟合优度R2≈0.98，表明该时间响应可用表观一级指数衰减模型描述，其动力学行为与一级界面反应过程一致。SPR强度的下降反映了激光诱导AFG1层修饰所导致的界面有效折射率降低。初始阶段黄曲霉毒素分子增强局部折射率，加强等离子体响应；照射后结构修饰降低了分子极化率，导致SPR信号逐渐下降。

在讨论部分，研究人员分析了黄曲霉毒素分子在裸露金表面的直接吸附检测机制。在不存在生物识别层的情况下，检测依赖于黄曲霉毒素分子在金表面的直接吸附，其在倏逝场穿透深度内扰动局域介电环境。三种类似物之间取代基和环饱和度的结构差异影响其吸附亲和力、表面覆盖率和吸附层组织，共同决定金属-介电界面的有效折射率变化及SPR共振角偏移幅度。此外，等离激元-分子相互作用在光激发下可能改变吸附分子层的局域介电响应。关于绿激光照射下的动态响应，研究人员指出黄曲霉毒素特别是AFB1在紫外和可见光照射下会发生光诱导结构修饰，虽然本研究中的照明条件与传统光化学研究不同，但表面等离激元激发产生的局域电磁场可能改变吸附分子层的光学环境并促进等离激元介导的界面过程。在溶解氧存在的条件下，这些效应可能促进活性氧（ROS）相关反应，导致吸附的AFG1层逐渐修饰。归一化SPR谱在照射约20分钟后出现的凹陷展宽和畸变支持了这一解释。这些结果共同表明，该SPR平台不仅能够对黄曲霉毒素进行高灵敏和差异性响应，还具备在受控外部光学激发下监测动态界面变化的能力。

研究结论部分可翻译如下：本研究展示了一种基于调制的表面等离子体共振（SPR）传感平台，采用相位敏感锁相检测，用于黄曲霉毒素B1、G1和G2的无标记定量和区分。该系统采用Kretschmann-Raether构型和35 nm金传感层，产生可重复的分析物特异性角度响应，并实现低仪器检测限，证明了其在无需生物识别元件和样品预处理的情况下定量区分结构相似黄曲霉毒素类似物的能力。相位敏感检测有效抑制低频噪声并提高测量稳定性，实现具有增强信号质量的可靠SPR测量。时间分辨实验进一步证明了该平台监测动态界面过程的能力，突出了其在实时传感应用中的潜力。总体而言，研究结果确立了基于调制的SPR作为一种稳健、计量学可靠且实际可及的黄曲霉毒素快速检测方法，其优势在于无标记、无试剂操作和简化仪器。未来工作将侧重于在更宽的浓度范围内扩展校准，验证在复杂食品基质中的性能，并集成自动化样品处理和选择性识别层，以进一步提高分析选择性并促进在实际食品安全监测中的应用。