FRET驱动的比率型传感器用于活细胞内MKI67转录本的高保真度检测

《Microchemical Journal》：FRET-driven ratiometric sensor for high-fidelity intracellular profiling of MKI67 transcripts in living cells

　　

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  一种31 nt的FRET传感器，具有28 nt识别区域，可识别MKI67 mRNA。
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  靶标结合产生红褐色至青色的颜色变化，检测限为0.29 nM。
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  逐像素FAM/TAMRA图谱揭示了活细胞中MKI67响应性信号。
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  该方法为细胞内生物标志物可视化提供了多功能平台。

引言

细胞增殖失控是癌症的特征之一，并参与肿瘤生长、复发和转移 [1]、[2]。因此，可靠地评估增殖活性对于肿瘤分类、预后评估和治疗策略至关重要 [3]、[4]。Ki-67是一种广泛使用的增殖标志物，其蛋白表达通过免疫组化（IHC）在固定组织标本中评估 [5]。相应的MKI67转录本可提供转录水平的信息。尽管MKI67 mRNA与Ki-67蛋白在生物学上相关，但它们的丰度并不等同，因为转录、翻译和分子周转共同决定最终蛋白水平 [6]。已有研究报道MKI67 mRNA测量与Ki-67 IHC评分在临床样本中不完全一致 [7]、[8]。因此，细胞内MKI67 mRNA的测量可被视为一种互补方法，用于研究转录水平变化及对实验扰动的响应。

经典技术如RT-qPCR可对批量样本中的mRNA进行敏感测量，但RNA提取过程会丧失转录本分布和细胞异质性的空间信息 [9]、[10]。原位杂交可保留空间信息，但通常需要细胞固定，且不适用于活系统的重复观察。荧光寡核苷酸探针为细胞内RNA成像提供了直接途径，但仅产生单一发射信号的探针仍依赖于绝对荧光强度。该强度可能因探针递送、细胞内探针浓度、焦平面、局部极性或pH值、光漂白以及仪器设置的不同而发生变化 [11]。此外，微小的亮度差异难以通过视觉辨别，且可能因图像采集或显示处理而发生改变 [12]、[13]。这些局限性产生了互补分析策略的需求，即既要保留空间信息，又要为信号解释提供内部参考。

比值荧光传感通过记录两个发射信号并将其强度比作为分析输出，恰好满足了这一需求。F?rster共振能量转移（FRET）非常适合这种设计，如我们之前的工作所展示的 [14]、[15]，因为其效率取决于供体和受体之间的距离及相对排列。寡核苷酸探针的靶标诱导结构变化因此可以在增加供体发射的同时降低受体发射，从而产生两个方向相反的响应信号。与单通道测量相比，比值荧光法减少了探针丰度变化和采集条件变化的影响 [16]、[17]，因为这些因素会同等程度地影响两个通道。双发射响应还可以产生颜色或色调的变化，而不仅仅是亮度的变化，这提高了定性或半定量观察中的视觉辨别能力 [18]、[19]。由于人眼对色调变化的敏感度高于亮度变化 [20]、[21]，这种双信号颜色变化赋予了裸眼半定量分析的独特优势 [22]。

然而，活细胞中的可靠比值输出不仅仅需要一个高效的FRET开关。天然寡核苷酸易受细胞内核酸酶降解，探针的切割可在无靶标结合的情况下使荧光团分离，从而产生假阳性响应 [23]、[24]。糖磷酸骨架的化学修饰可以提高核酸酶抗性，前提是保留靶标识别和结构转换功能 [25]、[26]。图像分析带来了第二个挑战。单独的荧光通道或合并图像本身无法校正探针摄取不均匀性 [11]、光学切片差异 [25] 或图像采集过程中引入的变化 [26]。因此，可靠的细胞内方法应结合稳定的分子支架与基于数学处理对两个通道的原始信号进行逐像素比值计算（$F_{\mathit{FAM}}/F_{\mathit{TAMRA}}$）。这种组合实现了空间分辨的相对测量，同时降低了对局部探针丰度及其他乘性信号变异来源的依赖性。

鉴于需要一种能在活细胞中运行并可与Ki-67 IHC互补的转录水平定量工具，本工作的目标是实现此类系统中MKI67 mRNA的相对监测。本研究开发了一种基于FRET的比值型寡核苷酸传感器，用于MKI67转录本检测。如图1所示，与之前依赖有限环区进行识别的发夹探针不同 [27]，本传感器通过全面筛选全长靶标mRNA序列，在其31 nt架构中嵌入了一个延长的28 nt识别区域，即其90.3%的序列参与靶标识别。该反义探针自发形成茎环结构，对靶标具有高特异性，而最大化的互补性增强了结合亲和力，从而实现了更低的检测限和更灵敏的比色响应 [28]。在无靶标存在时，FAM与TAMRA之间的近距离支持FRET并产生主导的TAMRA发射。与互补的MKI67序列杂交时，发夹结构打开，FAM发射增强，TAMRA发射降低，导致颜色从红褐色转变为青色。全链2'-O-甲基化（2-OMe）和环区磷酸硫酯（PS）连接被引入以限制核酸酶诱导的切割 [29]、[30]。对于细胞成像，逐像素FAM/TAMRA比值图谱使用TAMRA作为内部参考，以减少探针丰度差异和图像采集差异的影响。本工作的创新之处在于将高密度识别架构与双通道响应、可见色调变化、耐核酸酶的2-OMe/PS修饰以及逐像素FAM/TAMRA比值成像进行了整合。这些整合特性对于高保真细胞内表征至关重要，因为它们共同支持广泛的靶标识别、抑制核酸酶诱导的假阳性信号、减少对探针丰度和图像采集变化影响的依赖性，并验证靶标依赖的细胞响应。总体而言，本工作建立了一个分析平台，用于培养活细胞中MKI67转录本的相对监测，并代表了一种在经序列特异性验证后可适配其他细胞内RNA靶标的设计方案。

章节摘要

三维荧光激发-发射矩阵（EEM）映射

为表征荧光团的光学性质，记录了游离FAM和TAMRA染料（各100 nM）的三维荧光光谱。在EEM采集过程中，发射波长范围保持恒定，而激发波长以2至5 nm的步长进行增量扫描。激发和发射狭缝宽度分别设置为10 nm和5 nm。发射光谱以中等扫描速度采集，间隔为1 nm。

灵敏度与靶标检测

对于典型的

设计原理与光学表征

理性设计了一种FRET驱动的比值型寡核苷酸传感器。如图1a所示，其广泛的谱重叠满足了高效FRET的主要热力学前提。随后验证了传感器的FRET介导的靶标识别能力（图1b）。靶标的添加触发了FAM发射的大幅25.44倍增强，同时伴随TAMRA发射降至0.23倍。有趣的是，TAMRA的变化

结论

总之，本研究开发了一种基于FRET的比值型寡核苷酸传感器，用于活细胞中MKI67 mRNA的高保真表征。通过在紧凑的31 nt茎环架构中集成延长的28 nt识别区域，该传感器实现了0–100 nM的线性检测范围和0.29 nM的超低检测限，同时具有易于辨别的比值型颜色变化。全链2'-O-甲基化和环区磷酸硫酯修饰提高了对RNase介导的

CRediT作者贡献声明

刘诗雨：撰写初稿、资金获取、概念设计。燕伟真：撰写—审阅与编辑、资金获取、正式分析、数据管理、概念设计。金泽夫：撰写—审阅与编辑、正式分析、数据管理。王万荣：验证。卢正东：验证。赵峰：撰写—审阅与编辑、验证、监督。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文所报告工作的已知经济利益冲突或个人关系。

致谢

本研究由以下基金资助：中南大学中央高校基本科研业务费专项资金（编号：1053320251179）、中南大学湘雅医学院研究生跨学科创新孵化计划（编号：2026JCCXA001、2026JCCXB008）。

刘诗雨|燕伟真|金泽夫|王万荣|卢正东|赵峰