用于高灵敏度化学发光免疫分析的生物正交聚合物刷磁珠生物界面

《Microchemical Journal》：Bioorthogonal polymer-brush magnetic bead biointerfaces for high-sensitivity chemiluminescence immunoassay

　　

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  开发了用于CK-MB检测的正交聚合物刷磁性微球。
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  SPAAC实现了DBCO修饰抗体的定向固定。
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  通过调节GMA/PEGMA比例优化了叠氮基密度和抗污性能。
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  优化后的微球实现了25.3 pg/mL的CK-MB检测限。
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  该平台在临床血浆样本中表现出优异的稳定性和准确性。

引言

在化学发光免疫分析中，检测灵敏度对于准确测量低丰度生物标志物至关重要，直接决定了早期诊断和预后评估的可靠性。[1]，[2]，[3]，[4]，[5]，[6]，[7]，[8] 超顺磁性Fe₃O₄纳米颗粒因其无毒、优异的生物相容性和独特的磁性响应特性，是理想的固相载体。[9]，[10]，[11]，[12]，[13]，[14] 由此衍生而来的Fe₃O₄@聚合物核壳微球还具有高磁饱和、快速磁响应和单分散性等优点，为可重复性和通量奠定了物理基础。[15]，[16]，[17] 微球表面功能团的化学性质、密度和偶联效率决定了捕获抗体的固定量、取向和活性，从而影响检测的特异性和灵敏度。[18]，[19]，[20]，[21]，[22]，[23] 传统策略依赖羧基、氨基、对甲苯磺酰基或NHS酯修饰的微球，需要EDC/NHS活化、戊二醛交联或苛刻的高pH偶联条件，这些方法常导致蛋白质聚集、抗体随机取向和活性丧失，限制了灵敏度的进一步提升。[24]，[25]，[26]

生物正交化学将点击化学拓展至生物体系，在纳米医学领域展现出巨大潜力。[27]，[28]，[29]，[30] 无铜反应如应变促进叠氮-炔环加成（SPAAC）和逆电子需求Diels-Alder反应（IEDDA）具有高选择性、快速动力学和优异的生物相容性，能够在复杂的生物环境中精确形成共价键，同时避免过度副反应和表面功能团带来的限制。[31]，[32]，[33]，[34]，[35]，[36]，[37] Gai等人[38]采用基于糖基的抗体修饰策略，通过无铜点击化学将叠氮修饰抗体偶联到DBCO功能化脂质体上，实现了抗体在囊泡表面的位点特异性固定。Van Zundert等人[39]利用点击化学将CD44和EGFR抗体连接到纳米颗粒上，实现了受体特异性癌细胞靶向。最近，Chen等人[40]证明，脂质纳米颗粒上的理性抗体展示相比随机抗体偶联显著提高了靶向mRNA递送效率。这些进展表明，生物正交反应为构建具有高偶联选择性和良好生物分子识别活性保留的生物分子固定平台提供了高效且温和的工具；然而，将此类反应拓展至磁性微球表面以系统改善免疫分析中的生物分子识别性能仍 largely 未被探索。

在此，我们报道了一种整合表面引发原子转移自由基聚合（SI-ATRP）与无铜点击化学的理性设计，以构建高性能免疫分析平台。具体而言，首先在Fe₃O₄@聚合物磁性微球上生长富含环氧基的P(GMA-co-PEGMA)聚合物刷，随后通过环氧基团开环实现叠氮功能化。然后通过应变促进叠氮-炔环加成（SPAAC）将DBCO修饰的抗CK-MB抗体共价偶联。三维刷状结构使得可以通过改变GMA/PEGMA比例来调节前驱环氧基密度、叠氮功能化程度、可点击位点可及性和抗污性能。与传统的随机偶联方法相比，该策略有望实现更有效的抗体固定并保留高生物活性，显著增强信噪比，并获得低检测限。最终，本研究为下一代超灵敏免疫诊断提供了稳健且可推广的界面工程范式。

章节摘要

材料

三氯化铁六水合物（FeCl₃·6H₂O）、无水醋酸钠（C₂H₃NaO₂）、乙二醇（98%）、甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA，97%）、聚乙二醇单甲醚甲基丙烯酸酯（PEGMA₄₇₅，97%）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF，无水，99.8%）、甲苯（无水，99.8%）、乙醇（95%）、异丙醇（95%）、二氯甲烷（95%）、3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）、4-溴甲基-7-甲氧基香豆素（C₁₁H₉BrO₃）、4-二甲氨基吡啶（DMAP）、磺酰基Cy5-DBCO（C₅₂H₅₆N₄O₁₁S₃）、铜(I)

叠氮功能化聚合物刷磁性微球的制备

如上所述，为克服传统EDC/NHS偶联的局限性，包括可能的活性位点遮蔽、抗体非均匀附着和生物活性丧失，我们整合了SI-ATRP衍生聚合物刷工程与无铜SPAAC点击化学，构建了用于高灵敏CK-MB化学发光免疫分析的磁性微球平台。如图1所示，首先通过溴引发的磁性微球共聚合GMA和PEGMA

结论

总之，通过整合SI-ATRP介导的聚合物刷工程与SPAAC生物正交点击化学，构建了用于高灵敏CK-MB检测的功能磁性微球平台。通过调节GMA/PEGMA投料比，微球界面在可点击位点密度、抗体固定能力和抗污性能之间实现了有效平衡，其中FPG₈P₂-N₃表现出最佳的综合性能，信噪比约为1451。

CRediT作者贡献声明

聂英睿：原稿撰写、可视化、验证、方法论、概念化。陈鑫宇：验证、软件、调查、形式化分析。蒋勇：审稿与编辑、监督、资源、资金获取。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文所报告的工作。

聂英睿|陈鑫宇|蒋勇