用于超灵敏HIV-1 p24检测的级联放光电化学发光双模生物传感器

《Microchemical Journal》：Cascade amplified photoelectrical-chemiluminescence dual-mode biosensor for ultrasensitive HIV-1 p24 detection

　　

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  开发了一种光电 - 化学发光（PE-CL）双模生物传感器用于 p24 检测。
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  双模生物传感器实现了信号交叉验证并减少了干扰。
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  设计了一种多信号放大策略以提高检测灵敏度。
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  该生物传感器具有优异的检测限（PE/CL 分别为 5.58/2.27 pg/mL）。
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  在真实样品中，该生物传感器回收率为 94.0%–106.1%，且特异性高。

引言

HIV 感染仍然是持续存在的全球健康危机，及时准确的诊断对于遏制病毒传播和改善临床结果至关重要。在急性期（暴露后前 2–3 周内），病毒复制急剧上升，导致病毒血症异常升高，而血清学标志物在很大程度上仍无法检测到 [1], [2]。最早的诊断生物标志物之一是 HIV-1 衣壳蛋白 p24，通常在感染后 10 至 14 天检测到，早于抗体血清转化 [3], [4], [5]。这种早期出现使得 p24 在缩短诊断窗口期方面具有独特价值，与基于抗体的检测相比 [6]，因为急性感染者传染性极强但血清阴性，这突显了在易于传播期间减少漏诊对超灵敏 p24 检测的迫切需求 [7], [8]。目前，已建立了多种 HIV 诊断方法，包括聚合酶链反应（PCR）[9], [10], [11], [12]，ELISA [13], [14], [15], [16]，基于荧光的免疫测定 [17], [18], [19]，侧向层析快速检测 [13]，化学发光（CL）[20]，局域表面等离子体共振（LSPR）[21] 和表面增强拉曼光谱（SERS）[18]。尽管这些方法在检测速度或可及性方面具有优点，但它们通常面临高成本、抗干扰能力差或灵敏度不足等问题。值得注意的是，大多数方法依赖于单模检测，由于固有的技术权衡，无法平衡高灵敏度、强抗干扰性、操作简便性和定量准确性 [22]。这些局限性突显了对多功能诊断平台的迫切需求 [23]。

双模生物传感器通过整合互补的信号通路并提供独立的信号验证来解决这些挑战，从而在复杂的生物基质中提高分析信心和可靠性，同时将快速筛查与超灵敏定量相结合 [24], [25], [26]。作者此前开发了基于波纹状 AuSi 肖特基纳米结内热电子调控的高性能光电（PE）传感器（非常适合现场检测）[27], [28]。然而，基于 SPR 的 PE 传感器对于早期 p24 检测缺乏足够的灵敏度。同时，PE 传感可能会受到环境干扰，如温度漂移、气泡、非特异性吸附和基质干扰，这可能损害现场分析期间的信号稳定性和定量可靠性。为了提高 PE 传感器的检测灵敏度，必须引入信号放大系统。在我们的先前工作中，开发了多种 CL 生物传感器用于病原体和外泌体检测，具有高信噪比 [29]。这两种模式表现出固有的互补性：PE 传感擅长实时现场监测和抵抗溶液浑浊，而 CL 传感具有低背景和高定量准确性。

在本工作中，我们报道了一种级联放大 PE-CL 双模生物传感器，将两种互补的传感机制整合到单一的 AuSi 纳米结平台中，协同利用其固有优势，在急性感染期间实现敏感、准确和可靠的 HIV-1 p24 检测。在存在目标 p24 时，引入连接抗 -p24 抗体的金纳米粒子（Ab2-AuNPs-S）后，会形成三明治免疫识别结构，该金纳米粒子功能化了触发 S 链。三明治复合物上暴露的 S 链随后通过 HRP-AuNPs（HRP-AuNPs-H1 和 HRP-AuNPs-H2）锚定的 H1/H2 发夹链的特异性杂交，启动 HCR 介导的核酸级联放大。这种两步放大将超低的 p24 识别转化为丰富的 HCR 产物，通过 SPR 增强的热电子发射诱导 PE 信号，并通过 HRP 催化的鲁米诺 -H?O?反应引发 CL 信号。与单模检测相比，互补的双模策略提供了独立的信号验证并增强了定量可靠性，特别是在复杂基质中低丰度的 p24 检测中。

部分片段

双模生物传感器装置的设计、制造和实验设置

首先使用尼康 NSR i-line 步进式光刻机在 10 cm n-Si 晶圆（1–10 Ωcm）上对 500 nm 厚的光刻胶（Shipley 1805）层图案化纳米光栅。图案通过干法刻蚀工艺，具体使用反应离子刻蚀（RIE）系统（Tegal 903e）转移到硅基板中。在光栅区域外部，沉积了 10 nm Al?O? 和 200 nm SiO? 双层作为后续电极沉积的绝缘层。随后，堆叠了 1 nm Ti 和 50 nm Au

PE-CL 双模生物传感器的示意图及其工作原理

在本研究中，开发了一种级联信号放大生物传感方法用于双模检测，通过同时增强 SPR 响应和 CL 信号（图 1）。如图 1A 所示，传感器由镀有薄膜金膜的硅光栅组成，通过步进式光刻在晶圆尺度上制造 [33]。光栅参数设置如下：周期（P）= 900 nm，宽度（W）= 600 nm，高度（h）= 28 nm，金膜厚度（H）= 50 nm。聚二甲基硅氧烷 (PDMS) 微流控

结论

总之，我们开发了一种级联放大 PE-CL 双模微流控生物传感器，充分利用了两种独立信号转导通路的协同互补优势，实现了对 HIV-1 p24 抗原的超灵敏、特异和可靠的定量。该传感器整合了定向抗体固定、金纳米粒子辅助的蛋白 - 核酸信号转换以及基于 HCR 的核酸放大，以协同增强传感灵敏度并

CRediT 作者贡献声明

Zhicheng Deng: 写作 – 初稿，方法论，调查，形式分析，数据管理。 Yucong Huang: 写作 – 初稿，方法论，调查，数据管理。 Jaruratana Khantiratana: 写作 – 审阅与编辑，写作 – 初稿，调查。 Yongjian Li: 写作 – 初稿，验证。 Qin Chen: 写作 – 审阅与编辑，验证，项目管理，形式分析，构思。 Dan Gao: 写作 – 审阅与编辑，写作 – 初稿

利益冲突声明

作者声明没有已知的竞争性经济利益或个人关系，这些利益或关系可能影响本文报告的工作。

致谢

本工作得到了 广东省纳米光子学操控重点实验室 开放基金（编号 2023B1212010008）的资助。

Zhicheng Deng|Yucong Huang|Jaruratana Khantiratana|Yongjian Li|Qin Chen|Dan Gao