《Molecular Ecology Resources》：Is There a Fly in My Soup? To What Extent Do Metabarcoding and Individual Barcoding Tell the Same Story?
编辑推荐：
宏条形码已成为表征复杂节肢动物群落的首选方法。宏条形码处理后的批量样本能在多大程度上恢复与对所有个体逐一测序相同的群落组成，此前仍缺乏量化。不同类群DNA提取效率不均、引物错配以及非随机PCR等偏差可能导致物种从宏条形码数据中选择性丢失；同时，DNA宏条形码可
宏条形码已成为表征复杂节肢动物群落的首选方法。宏条形码处理后的批量样本能在多大程度上恢复与对所有个体逐一测序相同的群落组成，此前仍缺乏量化。不同类群DNA提取效率不均、引物错配以及非随机PCR等偏差可能导致物种从宏条形码数据中选择性丢失；同时，DNA宏条形码可能揭示并非以个体形式存在、而是以表面或昆虫肠道DNA残留形式出现的节肢动物类群。为了量化不同手段确定的样本含量的一致性，研究人员对45个批量昆虫样本进行了宏条形码分析，随后提取所有节肢动物并逐一测序。宏条形码靶向Folmer条形码区域3′端的418 bp，而个体条形码覆盖完整的658 bp Folmer区域。宏条形码工作流程，包括PCR扩增、测序和生物信息学分析，对每个样本的三个独立裂解液等分试样分别进行三次重复。对于主要分析，序列被分配到条形码指数号（BIN）作为各数据类型间相同的分类类别，从而能够检测即使是稀有但生物学上真实的类群。由于这种基于参考库的验证对于任何仅处理宏条形码数据的研究者来说都是不可用的，研究人员通过另一种工作流程（即从头聚类序列）验证了关键发现。研究发现，宏条形码是可重复的，因为同一样本的不同重复恢复了相似的物种丰富度和组成。个体条形码和宏条形码对群落结构的相对差异提供了相似的印象：物种丰富与物种贫乏样本的排序在不同数据类型间相似（Spearman's ? = 0.88–0.99），样本对间相对相异度的差异也相似（Spearman's ? = 0.55–0.90）。数据类型间的相异度随样本中BIN丰富度变化，但这种关系反映的是嵌套性而非周转：宏条形码恢复了与个体条形码相同的核心物种群，但在此之上增加了数百个物种。任何以个体形式恢复的BIN在宏条形码数据中被检出的概率很高，而任何在宏条形码中具有高读长丰度的BIN也大概率以个体形式存在（p > 0.8）。在丰度方面，每个BIN的个体昆虫数量可由宏条形码读长数良好预测（包含分类学作为随机效应的模型R2 > 0.68）。该分析表明，宏条形码数据在节肢动物物种丰富度、组成和类群特异性丰度方面能提供样本含量的信息。在宏条形码序列数据中以低拷贝数恢复的类群很可能代表过去生物互作留下的DNA残留。排除测序错误后，两种数据类型都能对源群落中存在的类群产生生物学相关见解。
宏条形码（Metabarcoding）已成为大规模表征复杂节肢动物群落的主流技术，但其能否完整再现样本中真实存在的物种组成，以及与逐一测序的个体条形码（Individual Barcoding）能否给出相同结论，此前缺乏量化评估。不同类群DNA提取效率差异、引物错配、PCR非随机扩增等均可能导致物种在宏条形码数据中丢失；同时，宏条形码也可能检测到并非以完整个体存在、而是以体表或肠道DNA残留形式出现的物种。为此，研究人员对45个马氏网（Malaise trap）采集的昆虫样本，先进行宏条形码（每样本三个重复），再分拣所有可见节肢动物个体进行个体条形码，系统比较两种数据的一致性。结果显示：宏条形码高度可重复，与个体条形码在群落丰富度排序和样本间相异度上高度一致；宏条形码检出的物种数多于个体条形码，差异源于嵌套性而非周转；个体存在的物种有很高概率被宏条形码检出，宏条形码高读长类群也大概率有个体存在；个体数量可由宏条形码读长数预测（R2 > 0.68）。这表明宏条形码能可靠揭示节肢动物群落的物种丰富度、组成和丰度信息，与个体条形码互补。该研究发表于《Molecular Ecology Resources》。
研究人员使用的主要技术方法包括：样本来源为瑞典及芬兰边境19个地点（18个在瑞典，1个在芬兰）的45个马氏网样本；宏条形码流程按已有方案提取总DNA，每个样本分成三个重复独立进行PCR扩增、建库，在Illumina NovaSeq 6000上测序；个体条形码流程为分拣全部个体，磁珠法提取DNA，扩增COI基因条形码区，在Sequel IIe平台进行SMRT测序；生物信息分析采用基于参考库的mBRAVE流程（将序列映射至BIN）和从头聚类OptimOTU流程（含DADA2、LULU等去噪步骤）；统计建模使用线性模型、逻辑回归和hurdle模型，并嵌套分类学随机效应。
研究结果可归纳为以下五个方面：
4.1 宏条形码在定性上是可重复的：通过比较同一样本三个重复间及不同样本间的相异度，研究人员发现同一重复间的S?rensen相异度平均为0.23（mBRAVE）和0.12（OptimOTU），而不同样本间分别为0.86和0.91；Simpson相异度也类似。物种丰富度在重复间高度一致（BINs：R2=0.997；de novo OTUs：R2=0.993），表明宏条形码具有良好的可重复性。
4.2 个体条形码和宏条形码提供了群落结构相对差异的相同印象：两种方法测得的样本丰富度高度相关（Spearman's ρ=0.88–0.99），样本对间的相异度也显著相关（mBRAVE r=0.69，OptimOTU r=0.90；Mantel检验p=0.0001）。S?rensen和Simpson相异度在方法间比较显示，同一样本两种数据间的相异度（S?rensen平均0.43，Simpson平均0.15）远低于不同样本间的值，说明两种方法对样本间相对差异的排序一致。
4.3 宏条形码揭示的类群远多于个体条形码：参考库方法中，宏条形码平均每样本比个体条形码多检出172个BIN（截距=172），斜率0.94表明随个体BIN增加，宏条形码新增BIN略少于一个。即使仅保留三个重复均检出的BIN，这种额外丰富度依然存在，而对照样本中BIN很少，说明额外物种并非主要来自交叉污染，而可能源于个体携带的DNA残留。S?rensen相异度随BIN丰富度增加而增加，Simpson相异度却不增加，证实方法间差异源于嵌套性而非周转。
4.4 我们可以通过一种数据中的丰度预测其在另一种数据中出现的概率：逻辑回归显示，即使仅以单一个体存在的BIN，在宏条形码中被检出的概率达83%（mBRAVE），随个体数量增加概率趋近1；反之，仅以单个读长出现的BIN，以个体形式存在的概率仅10%，读长数达1000时概率升至95%。加入分类学随机效应后，模型解释力显著提升（Tjur's R2从0.024升至0.46）。
4.5 我们可以从宏条形码读数部分预测个体丰度：hurdle模型以reads数和测序深度预测个体数，解释力R2=0.10（mBRAVE）；加入分类学随机效应后R2=0.30；基于留一样本交叉验证的预测R2=0.10。这说明丰度预测存在较大噪声，但分类学信息可显著改进。
讨论部分指出，宏条形码的高度可重复性支持其在实际应用中的可靠性，并建议通过重复测序控制随机变异。方法间的差异远小于不同诱捕器位置或朝向造成的生态采样差异，因此宏条形码适用于群落比较和生态监测。宏条形码额外检出的类群很可能源于捕食等生物互作留下的DNA，提供了比个体条形码更广的群落信息。丰度预测精度虽有限，但通过添加生物学spike-in或更精细的统计模型有望提高。
结论翻译为：总体而言，该研究结果为宏条形码作为可靠、可验证且高效揭示节肢动物群落的方法提供了令人鼓舞的前景。在足够采样深度和合适实验流程下，绝大部分存在的类群都能被宏条形码检出。在本研究中，即使只有单一个体存在，其检出概率也超过80%。因此，研究结果表明宏条形码确实能够兑现十多年前Ji等人（2013）提出的重大承诺。同时，宏条形码涉及一定程度的随机变异，但该变异相对较小，且可通过重复测序来降低其影响。该研究最重要的信息是：宏条形码将解析个体条形码无法捕获的群落特征，两种方法应被视为互补而非替代的关系。
