星形胶质细胞来源的细胞外囊泡磷酸化TDP-43作为肌萎缩侧索硬化症的血液生物标志物

《Neurobiology of Disease》：Astrocyte-derived extracellular vesicle phosphorylated TDP-43 as a blood-based biomarker for amyotrophic lateral sclerosis

　　

肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种致命的神经退行性疾病，约90–95%的病例以中枢神经系统（CNS）神经胶质TAR DNA结合蛋白43（TDP-43）病理为特征。目前亟需非侵入性生物标志物以减少诊断延迟、实现患者分层并评估临床试验中的治疗效果。鉴于星形胶质细胞参与ALS发病机制以及星形胶质细胞来源的细胞外囊泡（ADEVs）能够穿越血脑屏障并携带TDP-43，ADEVs代表了有前景的中枢神经系统液体活检生物标志物。在此，研究人员评估了在ADEVs中定量的TDP-43及其过度磷酸化的病理形式磷酸化Ser409（pTDP-43）的诊断性能，以区分ALS病例与匹配的健康对照。研究人员从三个ALS生物样本库/队列中的全血（n=76）和血浆（n=86）中免疫分离了ADEVs。ADEV质量和富集度按照细胞外囊泡研究最低信息指南进行验证，蛋白质水平通过四旋蛋白分化簇81（CD81）的比值进行标准化。诊断准确性通过逻辑回归和随机森林模型结合交叉验证进行评估，并在100个随机种子中调整年龄和性别。血浆ADEV pTDP-43/CD81比值最能预测ALS病例状态，逻辑模型的平均AUC为0.89（95% CI: 0.75–0.99），对应的平均敏感度和特异度分别为87%和89%；随机森林模型的平均AUC为0.86（95% CI: 0.82–0.90）。尽管ADEV pTDP-43相对于疾病模拟症的特异性及其与疾病进展的关联仍需进一步研究，但这些发现支持其作为ALS生物标志物候选物以及在TDP-43靶向临床试验中进行患者分层的潜力。

**星形胶质细胞来源的细胞外囊泡磷酸化TDP-43作为肌萎缩侧索硬化症血液生物标志物的研究解读**

肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis, ALS）是一种致命的神经退行性疾病，以运动神经元进行性丢失为特征，患者常在症状出现后1至5年内死亡。约90%–95%的ALS病例存在中枢神经系统（central nervous system, CNS）神经胶质细胞中TAR DNA结合蛋白43（TAR DNA-binding protein 43, TDP-43）的病理聚集。然而，目前ALS的诊断主要依赖临床表现，缺乏能够早期识别和区分ALS的体液生物标志物。由于血脑屏障的存在以及CNS源性分子在外周血中的稀释，直接检测血液中TDP-43的尝试结果并不一致。近年来，细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）因其能够穿越血脑屏障并携带母细胞分子货物，成为潜在的CNS液体活检工具。星形胶质细胞来源的细胞外囊泡（astrocyte-derived EVs, ADEVs）由于星形胶质细胞在ALS发病中的关键作用，以及其与脑血管的紧密联系，被认为是有前景的生物标志物载体。然而，ADEVs中TDP-43及其病理性磷酸化形式在ALS中的诊断价值此前尚未被系统评估。为此，研究人员在发表于《Neurobiology of Disease》的这项研究中，评估了ADEVs中的TDP-43和磷酸化TDP-43（phosphorylated TDP-43 at serine 409, pTDP-43）用于区分ALS与健康对照（healthy controls, HCs）的诊断性能。

研究人员使用了来自美国三个ALS队列/生物样本库（National ALS Registry pilot study、COSMOS、NEALS）以及两个对照样本库（BioIVT、BSR）的76份全血样本和86份血浆样本，病例与对照按性别匹配、年龄频数匹配。在方法上，研究人员首先比较了直接免疫沉淀法与两步法分离ADEVs的效率，选择富集程度更高的直接法；随后采用透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）和纳米颗粒跟踪分析（nanoparticle tracking analysis, NTA）表征ADEV形态与粒径；通过酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）检测星形胶质细胞标志物（胶质纤维酸性蛋白GFAP、谷氨酰胺合成酶GLUL）、神经元标志物（神经丝轻链NEFL、突触素SYP）以及EV标志物（CD81、CD63等），验证ADEV的富集和纯度；并通过比较不同标准化因子（CD81、CD63、总蛋白）对标志物变异系数的影响，确定以CD81比值作为标准化方法。最后，采用多变量逻辑回归和随机森林模型，结合100次随机种子的交叉验证，评估各生物标志物的诊断准确性。

结果部分的主要发现如下：
**3.1 ALS队列与对照的人口学特征**。全血样本中ALS病例38例，对照38例；血浆样本中ALS病例43例，对照43例，各组间性别比例和年龄分布匹配良好。
**3.2 ADEV的分离、富集与表征**。直接免疫沉淀法分离的ADEVs在CD81、GFAP、GLUL、NEFL和SYP水平上均显著高于两步法和总EV方法，且星形胶质细胞标志物的富集程度高于神经元标志物；TEM观察到典型杯状双层膜结构，NTA显示全血ADEV平均粒径119.3 nm，血浆ADEV平均粒径103.2 nm，符合EV特征。
**3.3 ADEV的标准化**。在全血中，以CD81比值标准化GFAP和GLUL时，变异系数最低；在血浆中，CD81比值同样优于CD63、TSG101和Syntenin，因此选择CD81作为标准化因子。
**3.4 ADEV TDP-43和pTDP-43生物标志物结果**。与HC相比，ALS患者全血和血浆ADEV中的TDP-43/CD81和pTDP-43/CD81比值均显著升高，其中血浆差异更显著（pTDP-43 p = 1.4e-10）。在调整年龄和性别后，血浆pTDP-43/CD81比值每增加一个标准差，ALS风险增加19.2倍（OR=19.2, 95% CI: 5.5–67.0）；其逻辑回归平均AUC为0.89（95% CI: 0.75–0.99），敏感度和特异度分别为85%和89%；随机森林模型平均AUC为0.86（95% CI: 0.82–0.90）。敏感性分析中，调整CD81后，血浆pTDP-43与ALS状态仍显著相关（OR=5.0/标准差）。此外，血浆pTDP-43/CD81比值与ALSFRS-R评分呈正相关（β=3.19，p=0.002），而采样时间与标志物水平无显著关联。

讨论部分指出，pTDP-43/CD81比值相较TDP-43/CD81比值具有更好的鉴别能力，与pTDP-43作为ALS病理标志物的角色一致。星形胶质细胞可能通过囊泡途径包装和释放病理性pTDP-43，这既可能是清除机制，也可能参与致病蛋白的传播。与神经丝相比，基于pTDP-43的ADEV生物标志物可能对ALS具有更高特异性，但对ALS拟似病（如原发性侧索硬化、进行性肌萎缩）的鉴别价值仍需进一步研究。本研究的优势包括样本量相对较大、多队列来源、盲法处理以及多种建模方法验证；局限性包括横断面设计、缺乏纵向数据以及未能直接评估疾病特异性。

结论部分（原文翻译）：总之，从全血和血浆中分离的ADEVs中测得的pTDP-43/CD81比值和pTDP-43，能够最强地区分ALS病例与健康对照，其次是TDP-43/CD81比值，其区分能力相对有限。尽管疾病特异性仍需在ALS拟似病和其他神经退行性疾病中进一步研究，基于TDP-43的ADEV生物标志物代表了一种有前景的、微创且可能可扩展的生物标志物候选物，可能有助于ALS的及时识别、改善患者分层，并支持TDP-43靶向临床试验中的评估。