《Neurobiology of Disease》：Effect of tau silencing on tau pathology propagation, a treatment efficient at the earliest stages of the disease?
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阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）中的认知下降与Tau病理的相关性比与淀粉样斑块更强，使得治疗焦点转向靶向Tau病理。Tau沉默疗法因可降低病理性Tau负荷而日益受到关注。然而，Tau沉默对Tau病理形成、扩散及认知缺陷的影响，尚未在
阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）中的认知下降与Tau病理的相关性比与淀粉样斑块更强，使得治疗焦点转向靶向Tau病理。Tau沉默疗法因可降低病理性Tau负荷而日益受到关注。然而，Tau沉默对Tau病理形成、扩散及认知缺陷的影响，尚未在表达野生型（wild-type，WT）Tau的AD或临床前模型中研究。研究人员在表达6种人WT Tau亚型的小鼠模型中，通过脑内注射人AD脑病理性Tau诱导Tau病理，考察Tau siRNA在病理诱导同时开始，或在病变出现后开始，对Tau病理进展的影响。病理诱导3个月后评估空间学习与Tau病理。结果显示：Tau沉默与病理诱导同时开始时，可挽救认知表现并减少Tau病理发展；而在Tau病变已有一定发展后给予Tau siRNA，则对认知表现和Tau病理传播均无效。结果表明，Tau沉默疗法应在疾病早期给药，才能在AD中对Tau病理发展产生治疗效果。
研究背景方面，AD是最常见的痴呆病因，其神经病理标志包括由淀粉样蛋白沉积形成的老年斑，以及由异常磷酸化和聚集的Tau蛋白组成的神经原纤维缠结（neurofibrillary tangles，NFTs）。在AD进展中，Tau病理以类朊病毒（prion-like）方式沿突触连接神经元传播。已有研究证实，表达6种人Tau亚型的hTau小鼠经人配对螺旋丝（paired helical filaments，PHF）-Tau脑内注射后可发生Tau病理传播。临床中，AD患者常在已出现病理改变后才被诊断，因此亟需明确Tau沉默在接近人类散发性AD传播模式下的作用。既往突变Tau模型如P301S小鼠仅表达单一人Tau亚型，且突变蛋白本身易聚集，难以区分细胞内在与细胞间传播机制；而WT Tau需被病理性Tau招募才会聚集，机制可能不同。已有靶向Tau的反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide，ASO）如diranersen（BIIB080）在早期发现可降脑脊液总Tau并减缓认知下降，但尚缺对Tau病理形成、传播与认知缺陷的直接证据。因此，研究人员首次在表达6种人WT Tau亚型的hTau小鼠中，用来源于人AD脑的PHF-Tau诱导病理，评价Tau siRNA的作用。
本研究发表于《Neurobiology of Disease》。研究人员得出核心结论：Tau沉默若在Tau病理诱导同时开始，可减少海马Tau病理形成并改善空间学习；若病理已建立再给药则无效，说明Tau lowering therapy存在有限治疗时间窗，对散发性AD样病理更具转化意义。
关键技术方法方面，研究人员使用来自比利时ULB脑库的散发性AD死者额叶皮质及非痴呆对照人脑样本制备sarkosyl不溶级分；以hTau小鼠（Jackson 005491，无内源鼠Tau、表达6种人WT Tau亚型）为模型，经立体定位将人AD sarkosyl不溶物注入海马齿状回；设同时给药与发病后给药两条时间线；采用FRET生物传感器细胞检测种子活性，以RT-qPCR和Western blotting测Tau转录与蛋白，以AT8、MC1及Gallyas染色量化病理，以Barnes迷宫和旷场行为学评价认知与运动焦虑，并以光片荧光显微镜观察Cy3-siRNA分布。
研究结果如下。
Tau silencing in tau transfected CHO cells and hTau mice：研究人员在转染3R或4R Tau的CHO细胞中用Tau siRNA，证实总Tau蛋白下降；在hTau小鼠齿状回注射后2周，海马人Tau mRNA与蛋白均显著降低，Cy3-siRNA信号局限海马并存于MAP2阳性神经元胞体，说明递送成功且神经元可内化。
Tau siRNA rescues spatial learning deficits when administered simultaneously with the induction of tau pathology：研究人员在AD级分注射同时给Tau siRNA，10周后Barnes迷宫中错误数与潜伏期改善，直接搜索策略使用率接近对照，说明同时沉默可挽救海马依赖空间学习，且非由焦虑或运动改变造成。
Tau silencing reduces tau pathology formation：同时给药组齿状回与Ammon角AT8阳性密度下降，MC1构象异常与Gallyas银染聚集减少；海马AT8密度与Barnes迷宫错误AUC呈强正相关，表明病理负荷与认知损害相关，Tau沉默抑制不同成熟阶段Tau病理。
Tau siRNA reduces the level of insoluble tau without affecting its seeding activity：研究人员提取海马sarkosyl不溶物，发现Tau siRNA组不溶性磷酸化Tau降低约40%；但FRET细胞中，小鼠来源级分与人AD来源相比种子活性低，且NT与Tau siRNA组间种子活性无差异，提示病理减少主要来自Tau可用性下降而非种子能力消除。
Tau reduction did not improve the spatial learning of mice exhibiting an established tau pathology before the start of the treatment：研究人员在AD注射6周后再给siRNA，又6周行行为学，两组Barnes迷宫错误、潜伏期和策略使用均随训练改善但组间无差异，说明已建立病理后沉默Tau不能改善空间学习。
Tau siRNA had no effect on tau pathology if administered after some development of tau lesions：同一后期时间线下，齿状回与Ammon角AT8密度仅呈非显著下降趋势，证明病变一定发展后单次Tau siRNA不能逆转已存在Tau病理传播。
讨论部分总结：研究人员指出，hTau小鼠加人AD来源PHF-Tau更贴近散发性AD的神经解剖传播。同时起始沉默可减少海马病理并改善学习，而后期起始无效，支持Tau沉默治疗窗有限。完全Tau敲除动物认知基本正常，说明降低Tau具安全性基础。与突变Tau模型不同，本模型无过表达促聚集突变，更能反映人WT Tau被招募聚集过程；已建立病理后，病理性Tau可不以 na?ve Tau为模板继续跨突触传播，因此仅降内源Tau不足以阻断进展。研究者还指出本研究未证明siRNA在3月仍具活性，且种子活性无差异可能受方法灵敏度限制；未来需在MAPT KI等生理表达模型、不同Tau病菌株中验证，并探索慢性给药与联合靶向种子、传播、清除的策略。
研究结论部分翻译：在本研究中，研究人员使用商品化Tau siRNA降低表达6种人Tau亚型、并由人AD脑异常Tau诱导病理的hTau小鼠中Tau表达。这些小鼠是更贴近AD中Tau病理传播的预临床模型。在病理诱导同时降低Tau可减少海马Tau病理形成，并与空间学习能力改善相关；相反，在Tau病理诱导一段时间后再开始Tau沉默，对空间学习和Tau病理传播均无影响。研究人员先在体外证明Tau siRNA降低3R与4R Tau，再由Cy3-siRNA确认其局限于海马并被神经元内化，齿状回给药2周即降低Tau转录与蛋白。已有文献显示Tau完全敲除小鼠学习和记忆基本正常，遗传消融Tau可挽救APP/PS1小鼠记忆损害，本研究发现Tau沉默组Barnes迷宫表现可达对照水平，且非焦虑或运动差异所致。人AD PHF-Tau注射后病理沿三突触海马回路由齿状回到Ammon角再到内嗅皮质；Tau沉默减少齿状回与Ammon角病变，但未影响内嗅皮质，也减少MC1与Gallyas阳性，说明干预了不同成熟度Tau病理。Tau siRNA降低不溶性Tau却不改种子活性，提示病理减少来自Tau可用性下降。后期给药实验表明Tau lowering therapy治疗窗有限；病理建立后内源Tau降低不足以影响进展，因为病理性Tau可独立于na?ve Tau继续传播，晚期治疗还需联用靶向种子、细胞间传播或促进清除的策略。总之，Tau沉默应在AD Tau病理最早阶段开始才具疗效，未来需在MAPT KI模型及不同Tau菌株中进一步验证慢性给药与联合疗法。
