关于帕金森病和阿尔茨海默病小鼠模型中pE79修饰的α-突触核蛋白具有相似酶促机制但不同细胞生成途径的证据

《Neurochemistry International》：Evidence for similar enzymatic but different cellular generation of pE79-modified α-synuclein in PD and AD mouse models

【字体：大中小】 时间：2026年09月12日 来源：Neurochemistry International 5.5

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　　 •α-突触核蛋白 (α-synuclein) 与其修饰酶 MMP-9 和 isoQC 在小鼠脑中共定位•帕金森病 (PD) 和阿尔茨海默病 (AD) 小鼠模型在 MMP-9 和 isoQC 的细胞类型特异性定位上存在差异•PD Thy1-aSyn 小鼠显示神经元 pE79-突

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α-突触核蛋白 (α-synuclein) 与其修饰酶 MMP-9 和 isoQC 在小鼠脑中共定位
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帕金森病 (PD) 和阿尔茨海默病 (AD) 小鼠模型在 MMP-9 和 isoQC 的细胞类型特异性定位上存在差异
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PD Thy1-aSyn 小鼠显示神经元 pE79-突触核蛋白积累
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AD tg2576 小鼠显示斑块相关的星形胶质细胞 pE79-aSyn 定位

引言

焦谷氨酸 (pE) 修饰的 α-突触核蛋白 (aSyn) 变体的形成涉及一个两步酶促过程，包括：(i) 全长 (FL) aSyn 的蛋白水解截短，以暴露出一个自由的 N 端谷氨酰胺残基；以及 (ii) 随后由谷氨酰肽环化转移酶 (QPCT，此处简称为 QC) 和谷氨酰肽环化转移酶样蛋白 (QPCTL，此处简称为 isoQC) 对 N 端谷氨酰胺进行环化 (Hartlage-Rübsamen 等，2021)。特别令人关注的 pE 修饰 aSyn 变体是 pE79-aSyn，因为已经证明它是由基质金属蛋白酶 -3 (MMP-3) 和 QC 的后续酶活性产生的 (Bluhm 等，2022a；Hartlage-Rübsamen 等，2021)。这种 pE79-aSyn 变体不形成纤维，但与 FL-aSyn 相比，它显示出更高的寡聚体形成率，这与其比单体具有更高的毒性相关 (Hartlage-Rübsamen 等，2021)。

为了确定参与这一两步催化过程的其他酶，本研究调查了基质金属蛋白酶 -9 (MMP-9) 和 isoQC 作为潜在的 aSyn 截短和 pE 形成酶。此外，为了阐明这种 pE79-aSyn 变体在交叉疾病病理学上的潜在相关性，研究了其在帕金森病 (PD) 的 Thy1-aSyn 小鼠模型和阿尔茨海默病 (AD) 的 tg2576 小鼠模型中的存在情况以及与 MMP-9 和 QC/isoQC 的潜在共定位。

在生理条件下，pE 修饰是神经肽和肽类激素的翻译后修饰 (PTM)。它保护肽类免受氨肽酶的降解，从而增强其稳定性并调节其生物活性 (B?ckers 等，1995；Pohl 等，1991)。pE 修饰可以通过 N 端谷氨酸 (E) 或谷氨酰胺 (Q) 残基的酶促环化生成。在人类中，已鉴定出两种具有环化活性的同工酶：QC 和 isoQC，它们具有相似的酶学特性，但亚细胞定位不同，QC 存在于分泌途径上，而 isoQC 是高尔基体驻留酶 (Cynis 等，2011；Schilling 等，2003；Stephan 等，2009)。这些酶也被证明参与了 AD 和 PD 等神经退行性疾病 (Hartlage-Rübsamen 等，2021；Schilling 等，2008)。虽然近年来关于 PD 中 aSyn 的 pE 修饰的研究主要集中在 QC 上 (Bluhm 等，2022a；Bluhm 等，2022b；Hartlage-Rübsamen 等，2021)，但 isoQC 在 aSyn 的 pE 修饰中的作用仍未被探索。

aSyn 蛋白由 140 个氨基酸 (aa) 组成，可以分为三个结构域：N 端两亲性区域 (aa 1-60)、非淀粉样成分 (NAC) 结构域 (aa 61-95) 和 C 端酸性区域 (aa 96-140) (Emamzadeh, 2016; Fusco 等，2014; Uversky 和 Eliezer, 2009)。早在 1993 年，就已经描述过 AD 患者淀粉样斑块中存在 NAC 片段 (Iwai 等，1995; Jakes 等，1994; Uéda 等，1993)。五年后，完整的 aSyn 蛋白被鉴定为 PD 和路易体痴呆中路易体的主要成分 (Spillantini 等，1998; Spillantini 等，1997)。因此，在该蛋白的生理功能被发现之前，其参与病理交叉疾病过程的情况就已经被揭示。即使在今天，aSyn 的生理作用仍未完全理解。然而，aSyn 蛋白在突触神经末梢和细胞核中的生理定位赋予了该蛋白其名称。这种特定的定位表明其在突触传递 (Burré, 2015; Cheng 等，2011; Lashuel 等，2013) 和转录调控 (Davidi 等，2020; Pinho 等，2019; Somayaji 等，2021) 中的作用。

在 PD 中，大部分 aSyn 蛋白携带翻译后修饰 (PTM)，如磷酸化、泛素化、SUMO 化、硝化、O-GlcNAc 化和截短 (Anderson 等，2006; Baba 等，1998; Fares 等，2021; Bluhm 等，2021; Zhang 等，2019)。

尽管神经元内包涵体中大约 15% 的 aSyn 代表截短形式 (Baba 等，1998; Campbell 等，2001; Muntané 等，2012)，aSyn 的蛋白水解切割仍然是一个被低估的 PTM。截短可能会损害 FL 蛋白的生理功能，并产生 N 端或 C 端片段，这些片段可能作为进一步 PTM 的底物。已知切割 aSyn 的酶包括 MMP，如 MMP-9 (Bluhm 等，2021; Levin 等，2009; Sung 等，2005)。

MMP-9 是一种锌依赖性内肽酶，由前肽、通过组氨酸残基协调锌离子的催化结构域、连接子和一个类血珠蛋白结合蛋白结构域组成 (Elkins 等，2002; Stute 等，2003)。这种蛋白酶在中枢神经系统的生理过程中起着关键作用，由神经元和胶质细胞表达 (Vafadari 等，2016)。顾名思义，MMP-9 在细胞外基质蛋白上具有调节功能。此外，该酶具有广泛的底物谱，包括生长因子及其相应前体、趋化因子和细胞因子、其他 MMP、细胞表面受体和细胞粘附分子 (Bajor 等，2012; Song 等，2015; Vafadari 等，2016; Vandooren 等，2013)。令人惊讶的是，目前已知 MMP 底物中只有 31% 是细胞外基质分子，而其余 69% 是非细胞外基质蛋白 (Dufour 和 Overall, 2015)。此外，MMP-9 通过调节树突棘形态参与突触可塑性 (Dziembowska 和 Wlodarczyk, 2012; Stawarski 等，2014)，并通过控制兴奋性突触的功能参与学习和记忆过程 (Ganguly 等，2013; Knapska 等，2013; Nagy 等，2007)。为了确保有限和受控的酶促微调，其催化活性在时间和空间上受到限制。失调的 MMP-9 活性已参与各种病理状态，如神经炎症 (Abraham 等，2005; Candelario-Jalil 等，2009; Vandooren 等，2014)、血脑屏障破坏 (Asahi 等，2001)、中风 (Chaturvedi 和 Kaczmarek, 2014; Yang 和 Rosenberg, 2015) 和神经退行性变 (Mroczko 等，2013; Yong, 2005)。已证明 MMP-9 在多个位点切割 aSyn，包括残基 78 和 79 之间，产生片段 Q79-140-aSyn (Levin 等，2009)。这种截短形式特别有趣，因为它暴露了一个 N 端谷氨酰胺，为通过 QC/isoQC 进行 N 端环化成 pE 提供了可能的底物。

综上所述，本研究调查了作为 aSyn 切割蛋白酶的 MMP-9、作为环化酶的 isoQC 以及 pE79-aSyn 修饰。我们专注于在 PD 和 AD 小鼠模型中调查 aSyn、pE79-aSyn 及其修饰酶的细胞类型特异性和亚细胞出现情况。本研究提供了 MMP-9 和 isoQC 在 PD 和 AD 交叉疾病背景下对病理性 pE-aSyn 修饰做出不同细胞贡献的证据。

章节片段

pE79-aSyn 蛋白的表达、纯化和聚集

为了确定 pE79-aSyn 抗血清 (生成方法描述见 Hartlage-Rübsamen 等，2021) 对不同 pE79-aSyn 蛋白聚集状态的特异性，该蛋白在大肠杆菌 (E. coli) 中通过编码融合有 TEV 蛋白酶切割位点和 GST/6-His 标签的 Q79-140-aSyn 序列的 pGEX-4T-1 载体表达。该重组肽的表达最近已被详细描述 (Bluhm 等，2025; K?ppen 等，2020)。简而言之，纯化过程包括 Ni²⁺ 螯合

pE79-aSyn 抗体检测 pE79-aSyn 蛋白的单体、二聚体和寡聚体状态

除了已经描述的 pE79-aSyn 抗血清对其目标蛋白 pE79-aSyn 的特异性（与 FL-aSyn、β-或 γ-突触核蛋白无任何交叉反应）(Hartlage-Rübsamen 等，2021)，我们在此探讨了抗体对不同聚集状态的 pE79-aSyn 蛋白的特异性问题。因此，在对重组 pE79-aSyn 蛋白进行分离之前，应用了既定的寡聚体制备聚集方案。图 1 中的 SEC 色谱图显示

讨论

此处通过免疫组织化学标记分析了 pE79-aSyn 的潜在两步催化生成。因此，结果在很大程度上基于这些抗体的特异性。所使用的 pE79-aSyn 抗血清识别 pE79-aSyn 单体和寡聚体，后者已在毒性背景下讨论过 (Bluhm 等，2025; Bluhm 等，2022a; Bluhm 等，2022b; Hartlage-Rübsamen 等，2021)。在这里，在点印迹分析中，我们证明 pE79-aSyn

局限性

尽管我们展示了 aSyn 与其修饰酶 MMP-9 和 isoQC 在免疫组织化学共定位上的一致结果，但仍有一些局限性需要考虑。首先，唯一具有经敲除组织验证特异性且针对 isoQC 和 pE79-aSyn 的抗体是在兔子中制备的，这阻止了它们在双染或三重免疫荧光标记中的同时使用。其次，如上所述，通过免疫荧光观察到的空间共定位并不能确立

结论

我们在 Thy1-aSyn PD 小鼠模型和 tg2576 AD 小鼠模型中鉴定了 pE79-aSyn 变体与可能参与从 FL-aSyn 连续生成该致病性肽段的酶之间的细胞共定位。这表明 pE79-aSyn 形成的机制可能在 PD 和 AD 病理之间共享。然而，模型在 pE79-aSyn 及其修饰酶的细胞分布方面存在差异，Thy1-aSyn 中具有较强的神经元成分

CRediT 作者贡献声明

Maike Hartlage-Rübsamen: 写作 – 审阅与编辑、方法论、调查研究、概念化。Steffen Rossner: 写作 – 初稿、监督、项目管理、资金获取、概念化。Charlotte Minister: 写作 – 审阅与编辑、验证、方法论、调查研究。Sarah Schrempel: 写作 – 审阅与编辑、可视化、调查研究、形式分析。Maria Antonia Joseph: 写作 – 审阅与编辑、调查研究。Max Holzer: 写作 – 审阅与

未引用参考文献

Grant 等，2014; Jan 等，2021。

伦理声明

本研究按照 ARRIVE (动物研究：活体实验报告) 指南进行。本研究已获得萨克森州地政厅批准。

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系，这些利益或关系可能影响本文中报道的工作。

致谢

本工作得到了 Else Kr?ner-Fresenius-Stiftung (资助号 # 2022_EKSE.163 给 SR 和 FR) 的支持。AB 获得了 Research Academy 资助的博士前奖学金，来自 Leipzig University。CM 是 Studienstiftung des Deutschen Volkes 博士奖学金的获得者。

引言