整合转录组分析揭示KLHL2下调通过WNK3/JNK/c-Jun轴作为阿尔茨海默病小胶质细胞炎症的潜在驱动因素

《Neurotherapeutics》：Integrative transcriptomic analysis reveals KLHL2 downregulation as a potential driver of microglial inflammation in Alzheimer’s disease via the WNK3/JNK/c-Jun axis

　　

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一种进行性神经退行性疾病，以显著的神经炎症为特征。小胶质细胞是中枢神经系统的常驻免疫细胞，在AD相关神经炎症中发挥关键作用，但调控其炎症激活的分子机制仍未完全阐明。在这项研究中，研究人员将人类单核RNA测序(single-nucleus RNA sequencing, snRNA-seq)与计算分析和实验验证相结合，以识别AD中炎症性小胶质细胞状态的潜在调控因子。研究人员对小胶质细胞亚群进行了表征，并进行了拟时间分析以推断跨神经病理阶段的转录状态转变。采用高维加权基因共表达网络分析(high-dimensional weighted gene co-expression network analysis, hdWGCNA)和机器学习来优先筛选候选基因进行功能验证。KLHL2被确定为候选调控因子，其表达沿推断的拟时间轨迹逐渐降低，在APP/PS1小鼠和Aβ₄₂刺激的BV2细胞中观察到Klhl2 mRNA和KLHL2蛋白水平一致降低。相反，WNK3表达水平升高，而Wnk3 mRNA没有相应变化。在BV2细胞中，Klhl2过表达降低了WNK3表达水平、JNK和c-Jun磷酸化以及促炎介质表达，而Klhl2敲低则产生相反效果。总之，这些发现支持KLHL2作为小胶质细胞炎症激活的负调控因子，并提示WNK3/JNK/c-Jun信号参与该过程。

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是最常见的神经退行性疾病，也是全球痴呆的主要病因，其典型病理特征包括β-淀粉样蛋白(amyloid-β, Aβ)沉积、过度磷酸化tau蛋白聚集体形成以及慢性神经炎症。尽管以Aβ和tau为靶点的疗法已有发展，但临床获益有限，提示其他病理机制如神经炎症在AD进展中起关键作用。小胶质细胞(microglia)是中枢神经系统的常驻免疫细胞，在神经炎症的启动、放大和消退中发挥核心作用。在AD病理刺激下，小胶质细胞发生显著的功能状态重塑，其炎症激活受细胞内信号通路严密调控，关键信号蛋白的水平和稳定性决定信号通路的活性。KLHL2（Kelch样蛋白2）是BTB-BACK-Kelch蛋白家族成员，作为CUL3-RING E3泛素连接酶复合物的底物适配器，已知可调节蛋白激酶WNK3的水平。然而，KLHL2是否在AD相关病理条件下调节小胶质细胞中的WNK3水平及下游炎症信号尚不清楚。基于此，研究人员综合运用人类单核RNA测序(single-nucleus RNA sequencing, snRNA-seq)数据、生物信息学分析和实验验证，系统探讨了KLHL2在AD小胶质细胞炎症中的潜在作用。通过细胞亚群表征、拟时间轨迹推断、高维加权基因共表达网络分析(high-dimensional weighted gene co-expression network analysis, hdWGCNA)和机器学习，研究人员将KLHL2确定为候选调控基因。在APP/PS1小鼠和Aβ₄₂刺激的BV2小胶质细胞中，他们验证了KLHL2表达下调与WNK3蛋白水平升高。功能实验表明，KLHL2过表达抑制WNK3/JNK/c-Jun信号和促炎介质表达，敲低则方向相反。该研究支持KLHL2作为小胶质细胞炎症激活的负调控因子，论文发表于《Neurotherapeutics》。

在技术方法上，研究人员从基因表达综合数据库(Gene Expression Omnibus, GEO)获取人类颞下回snRNA-seq数据集GSE268599，包含健康对照和不同Braak分期的AD样本，经质控、聚类和注释后识别小胶质细胞亚群；采用CytoTRACE 2和Monocle2进行拟时间分析；利用hdWGCNA构建共表达网络，并使用12种机器学习算法（以随机森林(random forest, RF)为最优）在GSE36980训练集及GSE109887、GSE118553、GSE125583、GSE173954四个外部队列中筛选候选基因。体内实验使用12月龄APP/PS1转基因小鼠与野生型小鼠脑组织，体外实验采用Aβ₄₂刺激的BV2小胶质细胞系（源自上海生命科学研究院）。通过定量PCR、Western blot、慢病毒介导的过表达和siRNA敲低等实验验证。

研究结果如下。

1. 单核RNA测序揭示AD中的小胶质细胞异质性：通过对GSE268599的分析，在31个样本中（1个健康对照、4个早期AD、8个中期AD、18个晚期AD）识别出7个转录上不同的小胶质细胞亚群，