急性及慢性甲基苯丙胺暴露食蟹猴中用于准确RT-qPCR归一化的条件特异性候选内参基因的鉴定与验证

《NeuroToxicology》：Identification and validation of condition-specific candidate reference genes for accurate RT-qPCR normalization in acute and chronic methamphetamine-exposed cynomolgus monkeys

　　

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  内参基因稳定性因METH暴露情况、年龄和样本类型的不同而异。
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  基于转录组筛选的候选基因优于常用内参基因。
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  内参基因的选择显著影响RT-qPCR归一化结果。
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  在所有实验条件下均未找到通用内参基因。
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  针对特定条件的验证对于METH暴露猕猴的准确RT-qPCR分析至关重要。

引言

逆转录定量实时荧光PCR（RT-qPCR）是基因表达分析中最广泛使用的方法之一，具有高度的敏感性、特异性和可重复性（Bustin et al., 2025, Ruiz-Villalba et al., 2017）。然而，准确量化在很大程度上取决于所采用的归一化策略。RNA质量、逆转录效率和PCR扩增的变异可能给RT-qPCR测量引入显著偏差（Kaluzna et al., 2017, Wang et al., 2020）。因此，利用稳定表达的内参基因进行适当归一化对于可靠的基因表达分析至关重要。尽管传统的内参基因如甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、β-肌动蛋白（ACTB）和酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-单加氧酶激活蛋白zeta（YWHAZ）已被广泛使用，但众多研究已表明，其表达稳定性因物种、组织、疾病状态和实验条件的不同而存在差异（Gong et al., 2016, Ho and Patrizi, 2021）。因此，使用未经验证的内看家基因可能导致不准确的生物学解释。

近期的研究强调，不存在通用的内参基因，应在具体的实验条件下对候选基因进行验证（Bustin et al., 2009, Ni et al., 2022）。基于转录组的方法提供了一种有效的策略，用于筛选具有相对稳定表达模式的基因，并已成功应用于多种生物体疾病模型中（Chang et al., 2010, Demidenko et al., 2011, Wang et al., 2017, Zhao et al., 2020）。与常用的内看家基因相比，基于转录组筛选的候选基因通常能提供更优的归一化准确性。因此，内参基因的经验性验证已成为RT-qPCR实验的一项重要要求，并被定量实时荧光PCR实验出版最低信息（MIQE）指南强烈推荐（Bustin et al., 2025）。

甲基苯丙胺（METH）是一种强效精神兴奋剂，对神经系统、心血管系统和免疫系统产生深远影响（Cadet et al., 2013, Prakash et al., 2017）。急性和慢性METH暴露会诱导广泛的转录改变并差异性调控多条信号通路（Casserly et al., 2023, McCoy et al., 2011）。此外，METH暴露的生物学反应可能因年龄和暴露时长的不同而存在差异（Kokoshka et al., 2000, Truong et al., 2005）。因此，在正常生理条件下被认为是稳定的基因在METH给药后可能并不一定保持稳定。尽管RT-qPCR被广泛用于研究METH诱导的分子改变，但大多数既往研究依赖于传统的内看家基因而缺乏系统性验证（Coutinho et al., 2008, Najera et al., 2016）。

非人灵长类动物（NHP）因其与人类在遗传学、生理学和解剖学方面的密切相似性而成为有价值的实验模型（Phillips et al., 2014, Singh and Olabisi, 2017）。恒河猴已被广泛应用于在多种实验方案下研究METH暴露的效应（Bae et al., 2022, Groman et al., 2012, Melega et al., 2008）。然而，尚无研究系统评估急性和慢性METH暴露恒河猴中的内参基因稳定性。此外，不同年龄分组、暴露方案和样本类型间的内参基因稳定性仍未得到充分表征。

在本研究中，我们对急性和慢性METH暴露恒河猴的血液和组织样本中的转录组筛选候选内参基因和常用内参基因进行了评估。内参基因的表达稳定性使用geNorm（Vandesompele et al., 2002）、NormFinder（Andersen et al., 2004）和BestKeeper（Pfaffl et al., 2004）进行评估，并通过几何平均分析进行整合。此外，我们使用FOSL2、JUN和NR4A1考察了内参基因选择对靶基因表达解释的影响。我们的目标不是确定通用内看家基因，而是提供针对特定条件的候选内参基因，并说明在不同METH暴露条件下进行准确RT-qPCR归一化的经验验证的重要性。

文章各部分内容摘录

实验动物

本研究纳入了18只健康的1–13岁恒河猴（17只雌性和1只雄性），均无参与药物研究的病史（表2）。这些动物来源于越南，通过中国（苏州西山中科实验动物公司）进口，并获得了《濒危野生动植物种国际贸易公约》（CITES）的许可。所有动物均由韩国国家灵长类研究中心（NPRC）提供。无特定病原体

候选内参基因的筛选

为鉴定在甲基苯丙胺（METH）暴露条件下具有稳定表达的候选内参基因（RG），我们分析了来自急性和慢性METH暴露恒河猴血液样本的转录组数据集。

对于急性暴露数据集，最初识别出39,149个聚类基因。在排除所有实验组中未稳定表达的基因后，剩余16,587个基因用于进一步分析。对于慢性暴露数据集，共识别出43,235个聚类基因

讨论

准确的RT-qPCR分析取决于在特定实验条件下选择具有稳定表达的内参基因（RG）（Bustin et al., 2025, Vandesompele et al., 2002）。在本研究中，我们系统地评估了急性和慢性甲基苯丙胺（METH）暴露恒河猴中，涵盖多个年龄分组和样本类型的转录组筛选候选内参基因和常用内参基因。我们的主要发现有三点。首先，内参基因稳定性

伦理声明

所有操作及动物使用均已获得韩国生物科学与生物技术研究所（KRIBB）机构动物护理和使用委员会的批准（批准编号：KRIBB-AEC-15046）。

利益冲突

作者声明不存在利益冲突。

资金资助

本研究由KRIBB研究启动计划基金资助（KGM4562633和KGM1072612）。

作者贡献声明

Choe Se-Hee：原始稿件撰写、验证、方法论、形式分析、概念构思。Cho Hyeon-Mu：原始稿件撰写、验证、方法论、形式分析。Park Sang-Je：审稿与编辑、原始稿件撰写、验证、方法论、调查研究、数据整理、概念构思。Ko Min-Gyeong：验证、方法论、调查研究。Lee Yun-Jung：验证、方法论、调查研究。Lee Ja-Rang：验证、方法论、调查研究。Park Hye-Ri：

利益冲突声明

作者声明不存在利益冲突。

Park Sang-Je|Choe Se-Hee|Cho Hyeon-Mu|Lee Ja-Rang|Park Hye-Ri|Ko Min-Gyeong|Lee Yun-Jung|Kim Young-Hyun|Huh Jae-Won