源自爪哇姜黄（Curcuma xanthorrhiza Roxb.）提取物的生物合成银纳米颗粒：体外与计算机模拟表征及其抗菌潜力

《Next Nanotechnology》：Biogenic silver nanoparticles from Curcuma xanthorrhiza Roxb. extract: Characterization and antibacterial potential in vitro and in silico

　　

抗菌素耐药性是对全球健康的主要威胁，削弱了传统抗生素的有效性。本研究旨在利用爪哇姜黄（Curcuma xanthorrhiza Roxb.）根茎乙醇提取物合成银纳米颗粒（CX-AgNPs），并评估其抗菌性能。CX-AgNPs在417–430 nm处表现出表面等离子体共振（SPR）吸收带，水合动力学直径为247.3 nm，多分散指数（PDI）为0.364，Zeta电位为–39.0 mV，表明其具有显著的静电胶体稳定性。傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析提示提取物来源的植物化学成分参与了纳米颗粒的还原与稳定化。场发射扫描电子显微镜（FESEM）和透射电子显微镜（TEM）分析显示纳米颗粒以球形为主，而能量色散X射线光谱（EDX）检测到84.7%的元素银，X射线衍射（XRD）分析表明其为结晶性面心立方（FCC）结构。通过肉汤微量稀释法进行的抗菌评估显示，CX-AgNPs对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的最低抑菌浓度（MIC）为62.5–125 μg/mL。CX-AgNPs还能以浓度依赖性方式抑制两种菌株的生物膜形成。补充的分子对接和密度泛函理论（DFT）分析表明，姜黄素（curcumin）表现出最优的计算特征，具有最高的预测结合亲和力、对关键晶体学相互作用的稳定重现以及有利的电子响应性。黄根姜黄醇（xanthorrhizol）则表现出相对更高的电子稳定性，而芳姜黄酮（ar-turmerone）显示出受体依赖性结合行为。总体而言，CX-AgNPs展现出作为有效抗菌剂的强大潜力。

论文解读：源自爪哇姜黄提取物的生物合成银纳米颗粒——表征、抗菌潜力及计算机模拟分析

一、研究背景与意义

抗菌素耐药性已成为全球公共卫生领域的重大威胁，严重削弱了传统抗生素的临床疗效。随着多重耐药菌株的不断出现，人类正面临后抗生素时代的严峻挑战。纳米技术的兴起为应对这一危机提供了新的思路，其中金属纳米颗粒因其独特的物理、化学和生物学性质而备受关注。在众多金属纳米材料中，银纳米颗粒（AgNPs）凭借其广谱、高效的抗菌活性，成为研究最为深入和应用最为广泛的纳米材料之一。AgNPs的抗菌机制具有多靶点特征，包括破坏细菌细胞膜、诱导氧化应激以及干扰细胞代谢过程等，这种多靶点作用模式显著降低了细菌产生耐药性的可能性。

然而，传统的AgNPs化学合成法和物理合成法往往涉及危险试剂、高能耗以及有毒副产物的产生，不符合绿色可持续发展的理念。植物介导的绿色合成法（phytofabrication）因其环境友好、成本低廉且可持续性强，成为替代传统方法的理想选择。该方法利用植物提取物中的活性成分，如酚类、黄酮类和萜类化合物，在温和条件下将银离子还原为金属银，并同时发挥稳定剂的作用。

爪哇姜黄（Curcuma xanthorrhiza Roxb.）是印度尼西亚广泛使用的药用植物，其根茎富含姜黄素类化合物（curcuminoids）和倍半萜类化合物（sesquiterpenes），如姜黄素（curcumin）、黄根姜黄醇（xanthorrhizol）和芳姜黄酮（ar-turmerone）等。这些植物化学成分具有酚羟基和羰基等官能团，能够有效促进银离子的还原并稳定纳米颗粒。然而，既往关于植物介导AgNPs合成的研究多集中于纳米颗粒的制备和常规抗菌活性筛选，缺乏对临床相关病原菌的系统性评估以及与计算模拟相结合的综合性研究。因此，本研究旨在利用爪哇姜黄根茎乙醇提取物合成银纳米颗粒（CX-AgNPs），系统表征其理化性质，评估其对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和铜绿假单胞菌的抗菌及抗生物膜活性，并通过分子对接和密度泛函理论（DFT）计算分析主要植物化学成分的潜在贡献。该论文发表在《Next Nanotechnology》期刊上。

二、主要技术方法

研究人员采用了实验与计算相结合的综合研究策略。在实验层面，首先通过Folin-Ciocalteu法和比色法分别测定提取物的总酚含量（TPC）和总黄酮含量（TFC）；随后利用爪哇姜黄根茎乙醇提取物与硝酸银在暗处振荡孵育合成CX-AgNPs，并对孵育时间、提取物浓度、硝酸银浓度及配比等参数进行优化。纳米颗粒的表征采用了多种先进技术，包括紫外-可见光谱（UV-Vis）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、动态光散射（DLS）、Zeta电位分析、场发射扫描电子显微镜-能量色散X射线光谱（FESEM-EDX）、透射电子显微镜（TEM）及高分辨透射电子显微镜（HRTEM）、X射线衍射（XRD）等。抗菌活性通过肉汤微量稀释法测定最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC），抗生物膜活性采用结晶紫染色法评估。在计算层面，研究人员从蛋白质数据库（PDB）获取MRSA靶蛋白（6O9S和2HYD）及铜绿假单胞菌靶蛋白（5U3B和3IX3）的晶体结构，利用AutoDockTools进行分子对接研究，并使用ORCA软件基于M062X泛函和6-31G(d)基组进行DFT计算。临床菌株MRSA M1和铜绿假单胞菌M2由印度尼西亚国家研究与创新署（BRIN）提供。

三、研究结果

总酚和总黄酮含量测定： 通过Folin-Ciocalteu法和比色法测定，爪哇姜黄根茎乙醇提取物的总酚含量为61.01 mg GAE/g，总黄酮含量为44.46 mg QE/g，表明酚类化合物在提取物中占主导地位，其丰富的羟基和羰基官能团有利于银离子的还原和纳米颗粒的稳定。

银纳米颗粒合成条件优化： 通过UV-Vis光谱系统评估各参数对合成效果的影响。24小时孵育时间产生尖锐且明确的SPR峰（418 nm），表明单分散性良好的纳米颗粒群体；10 mg/mL提取物浓度产生最强的SPR吸收带（429 nm），归因于丰富的植物化学物质提供充足的还原和稳定能力；5 mM硝酸银浓度产生最强的SPR峰（432 nm）和最高的纳米颗粒产率；提取物与硝酸银的最佳配比为1:9，产生狭窄的SPR带（445 nm），表明纳米颗粒均匀且稳定。

纳米颗粒表征： FTIR分析显示CX-AgNPs在3370、2951–2838、1511–1454、1373、1160–1054和808 cm?1处具有特征吸收峰，表明羟基、羰基等官能团参与了银离子的还原和纳米颗粒的表面封端稳定。DLS测得水合动力学直径为247.3 nm，PDI为0.364，Zeta电位为–39.0 mV，表明胶体系统具有优异的静电稳定性。FESEM和TEM分析显示纳米颗粒以球形为主，EDX检测到84.7 wt%的高含量元素银。HRTEM显示晶格条纹间距为0.244 nm，对应银的（111）晶面；SAED图案表明银的多晶性质。XRD分析在2θ=38.22°和46.29°处出现两个主要衍射峰，分别对应面心立方（FCC）结构的（111）和（200）晶面，与JCPDS卡No. 04-0743标准数据一致。

抗菌活性分析： 通过肉汤微量稀释法评估，CX-AgNPs对MRSA的MIC为125 μg/mL、MBC为250 μg/mL；对铜绿假单胞菌的MIC为62.5 μg/mL、MBC为250 μg/mL。CX-AgNPs对革兰氏阴性菌表现出更强的抑制作用，可能与两类细菌细胞壁结构的差异有关。相比之下，爪哇姜黄提取物对MRSA的MIC为125 μg/mL、MBC为1000 μg/mL，对铜绿假单胞菌的MIC为250 μg/mL、MBC为1000 μg/mL，表明纳米颗粒化显著增强了抗菌效力。

抗生物膜活性分析： 结晶紫染色法评估显示，CX-AgNPs以浓度依赖性方式抑制MRSA和铜绿假单胞菌的生物膜形成。在2 MIC浓度下，MRSA生物膜形成从对照组的100%降至17.303%，铜绿假单胞菌生物膜形成降至19.692%。铜绿假单胞菌在MIC归一化浓度下表现出更显著的生物膜抑制效果，可能与AgNPs干扰其群体感应系统和胞外聚合物产生有关。

分子对接研究： 通过将共结晶配体重新对接至各受体活性位点进行方法验证，所有RMSD值均低于2.0 ?阈值（6O9S为1.69 ?、2HYD为1.49 ?、5U3B为0.49 ?、3IX3为0.79 ?），确认对接参数可靠。对接结果显示，姜黄素在6O9S受体中结合亲和力为–7.18 kcal/mol，优于共结晶配体（–6.46 kcal/mol），并重现了SER391、ASN441和THR531等关键氢键相互作用；在3IX3受体中，姜黄素结合亲和力达–9.46 kcal/mol，超过共结晶配体（–8.63 kcal/mol），并与关键锚定残基SER129形成氢键。黄根姜黄醇在6O9S受体中结合亲和力为–6.42 kcal/mol，与SER91、SER439和ASN441形成氢键；在3IX3受体中结合亲和力为–8.79 kcal/mol，与SER129形成氢键并与CYS79形成疏水相互作用。芳姜黄酮在5U3B受体中与THR190形成氢键并重现多个疏水相互作用，但在2HYD和3IX3受体中与共结晶配体的相互作用重叠较少。

密度泛函理论分析： DFT计算显示，姜黄素的总电子能量为–1263.38 Eh，HOMO能量为–0.2609 eV（最高），LUMO能量为–0.0457 eV（最低），HOMO-LUMO能隙为0.2152 eV（最小），表明其具有最强的电子给体和受体能力以及最高的化学反应活性。黄根姜黄醇的HOMO-LUMO能隙最大（0.2968 eV），表明其电子稳定性更高但反应活性较低。芳姜黄酮的HOMO能量最低（–0.2861 eV），电子给体能力最弱。

四、讨论与结论

综合分子对接和DFT分析结果，姜黄素在所有评估靶标中均表现出最优的计算特征，包括最高的预测结合亲和力、对关键晶体学相互作用的稳定重现以及最有利的电子响应性，提示其可能在CX-AgNPs的抗菌活性中发挥重要作用。黄根姜黄醇表现出较大的HOMO-LUMO能隙，电子稳定性更高但反应活性较低，与其中等程度的对接亲和力一致。芳姜黄酮则表现出受体依赖性结合行为，其电子给体能力相对较弱。这些计算发现为理解爪哇姜黄提取物中主要植物化学成分的抗菌贡献提供了分子层面的理论依据。

本研究成功利用爪哇姜黄根茎乙醇提取物绿色合成了具有优异理化特性和抗菌活性的银纳米颗粒。CX-AgNPs对MRSA和铜绿假单胞菌均表现出广谱抗菌和抗生物膜活性，结合计算分析揭示的姜黄素潜在分子机制，为开发新型、可持续的抗菌纳米材料提供了重要的实验和理论依据。未来的实验和临床前研究有必要进一步评估CX-AgNPs的抗菌机制、安全性及治疗潜力，特别是用于局部抗菌应用的开发。