低温条件下杉叶藻（Hippuris vulgaris）对硝态氮的偏好与铵态氮的敏感性：氮同化、氧化平衡与植物激素响应的协同调控

《Plant Physiology and Biochemistry》：Nitrate preference and ammonium sensitivity of Hippuris vulgaris under cold conditions: coordination of nitrogen assimilation, oxidative balance and phytohormone responses

　　

低温制约水生植物对氮（N）的吸收与同化，然而不同无机氮形态在低温条件下如何调控植物生长与逆境生理仍鲜有研究。本研究将杉叶藻（Hippuris vulgaris）在2–10 °C条件下暴露于0、2、5、10、20和50 mg L-1 N的铵态氮（NH4+-N）或硝态氮（NO3--N）处理40天。在相同总氮浓度下，进一步设置不同NH4+-N/NO3--N比例的混合氮实验，以评估基于生长的氮形态偏好。研究人员测定了生长性状、组织氮积累、氮同化酶、抗氧化响应、一氧化氮（NO）信号及植物激素谱，以明确氮形态响应。结果表明，杉叶藻对NO3--N的偏好明显高于NH4+-N。当NH4+-N浓度≥10 mg N L-1时，根系发育和生物量积累受到显著抑制，而NO3--N浓度高达50 mg N L-1时未引起类似的生长抑制。40天后，NO3--N处理下的重量增长率（WGR）为38.34%–141.83%，高于对应NH4+-N处理下的29.64%–63.48%；在混合氮处理中提高NO3--N比例进一步促进了鲜重积累。NO3--N的优势与较高的硝酸还原酶（NR）、亚硝酸还原酶（NiR）、谷氨酰胺合成酶（GS）和谷氨酸合酶（GOGAT）活性以及更高的组织氮积累相关。与NH4+-N相比，NO3--N降低了丙二醛（MDA）积累，维持了更高的抗氧化酶活性，并增强了根系NO信号。高浓度NH4+-N诱导脱落酸（ABA）积累，并与较弱的茉莉酸相关响应相关，表明激素调控向胁迫主导型转变。上述发现表明，氮同化、氧化平衡与植物激素重编程的协同调控构成了杉叶藻对NO3--N和NH4+-N截然不同响应的生理基础，为其在硝态氮主导的冷季水生环境中的应用提供了生理学证据。

低温条件下杉叶藻对硝态氮的偏好与铵态氮敏感性：氮同化、氧化平衡与植物激素响应的协同调控——论文解读

一、研究背景与科学问题

氮（N）是调控植物生长、光合作用、蛋白质合成及逆境适应的重要大量营养元素。在水生和湿地环境中，无机氮主要以铵态氮（NH₄⁺-N）和硝态氮（NO₃^--N）两种形式存在，二者在吸收、转运、同化及生理效应上存在显著差异。通常，NO₃^--N需先经硝酸还原酶（NR）还原为NO₂^--N，再经亚硝酸还原酶（NiR）还原为NH₄⁺-N，而NH₄⁺-N可通过谷氨酰胺合成酶（GS）/谷氨酸合酶（GOGAT）途径直接掺入氨基酸。尽管NH₄⁺-N在同化能耗上低于NO₃^--N，过量NH₄⁺-N常诱发毒性，包括根际和质外体酸化、离子失衡、根系发育受损、氧化损伤及植物激素稳态紊乱。不同水生植物对氮形态表现出物种特异的偏好和耐受阈值，因此识别氮形态偏好及毒性阈值对理解水生植物在富氮环境中的适应至关重要。

低温是温带地区水生大型植物面临的主要环境限制因素。冬季许多水生植物枯萎或进入休眠，削弱了植物介导的养分吸收和水体自净能力。低温可抑制光合作用、根系活力、膜转运及酶促反应，从而限制氮的获取与同化。特别是NO₃^--N的吸收与还原在低温下可能受限，因为硝酸盐同化需要还原力和ATP，且NR活性对温度胁迫敏感。冷胁迫还可促进活性氧（ROS）积累、膜脂过氧化和细胞损伤。同时，水温的季节性变化可能改变NH₄⁺-N和NO₃^--N的相对可利用性，冬末春初NO₃^--N往往更为丰富。

杉叶藻（Hippuris vulgaris）原产于内蒙古地区，是一种耐冷水生大型植物，能在寒冷季节维持生长，具有冬季水生植被恢复的潜在价值。该物种已被引种驯化至江苏温带地区，实现全年常绿。前期研究表明杉叶藻在低温下具有氮磷去除能力，但其在低温条件下对不同氮形态的响应差异、触发铵态氮敏感性的浓度阈值及潜在生理生化机制尚不明确。基于此，研究人员提出三个假设：其一，低温条件下杉叶藻在NO₃^--N供应下的生长优于NH₄⁺-N；其二，过量NH₄⁺-N通过损害氮同化和加剧氧化胁迫抑制根系发育和生物量积累；其三，杉叶藻对NH₄⁺-N和NO₃^--N的差异性响应与氮同化酶、氧化还原平衡、NO信号及植物激素谱的协同变化相关。该研究旨在明确杉叶藻在低温下对NO₃^--N的偏好和NH₄⁺-N的敏感性，并阐明其氮形态依赖性生长的生理生化机制。

二、主要技术方法

研究人员以采自江苏省中国科学院植物研究所的杉叶藻（15 cm，无根）为材料，在人工气候箱中（14 h光照10°C/10 h黑暗2°C）进行40天水培实验。设置11个处理组：N0（0 mg L^-1 N）、5个NH₄⁺-N浓度组（AN2、AN5、AN10、AN20、AN50）和5个NO₃^--N浓度组（NN2、NN5、NN10、NN20、NN50），浓度分别为2、5、10、20和50 mg L^-1。另设相同总氮浓度下不同NH₄⁺-N/NO₃^--N比例的混合氮实验。每2天更换营养液，每10天测定生长参数。主要技术方法包括：生长指标测定（鲜重、株高、根长、根系活力）；组织氮含量测定（NH₄⁺-N、NO₃^--N、无机氮IN和总氮TN）；氮转化酶活性测定（NR、NiR、GS、GOGAT）；抗氧化指标测定（超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶CAT、过氧化物酶POD活性和丙二醛MDA含量）；根系NO信号检测（DAF-2 DA荧光探针结合共聚焦显微镜）；植物激素检测（脱落酸ABA、生长素类、赤霉素类、细胞分裂素类、水杨酸SA、茉莉酸类，采用超高效液相色谱-质谱联用技术）；统计分析采用单因素方差分析、Tukey事后检验、Pearson相关分析、冗余分析（RDA）和通径分析。

三、主要研究结果

3.1 杉叶藻生长与氮含量对氮形态的响应

3.1.1 杉叶藻的生长响应

40天培养期间，NH₄⁺-N处理下的鲜重和重量增长率（WGR）显著低于NO₃^--N处理。随NH₄⁺-N浓度升高，鲜重呈倒U型变化，AN2处理达到峰值；而随NO₃^--N浓度升高，鲜重先增后趋稳，NN20处理最高。当环境NH₄⁺-N大于10 mg L^-1时，鲜重和根长自第10天起显著下降，降幅分别为6.74%–15.21%和38.77%–67.52%。根系活力随NH₄⁺-N浓度升高呈倒U型变化，AN10达到峰值。相比之下，随NO₃^--N浓度升高，鲜重和根长持续增长，研究中未观察到NO₃^--N的抑制浓度。Pearson相关分析显示，环境NH₄⁺-N与WGR和根长显著负相关，而环境NO₃^--N与WGR和鲜重显著正相关。据此推断，杉叶藻对环境NH₄⁺-N的耐受阈值为10 mg L^-1，高于苦草（Vallisneria natans）的4 mg L^-1和伊乐藻（Elodea nuttallii）的8 mg L^-1，但低于狐尾藻（Myriophyllum verticillatum）的12 mg L^-1；而对环境NO₃^--N的耐受阈值超过50 mg L^-1，高于轮叶黑藻（Hydrilla verticllata）的40 mg L^-1。

3.1.2 杉叶藻的氮含量响应

NH₄⁺-N和NO₃^--N处理下，杉叶藻组织NH₄⁺-N含量分别为0.015–0.097和0.018–0.109 g kg^-1，NO₃^--N含量分别为0.283–0.643和0.375–1.219 g kg^-1，IN含量分别为0.299–0.707和0.393–1.355 g kg^-1，TN含量分别为11.27–20.10和10.97–25.37 g kg^-1。当环境氮浓度超过10 mg L^-1时，NH₄⁺-N处理下植物TN含量显著低于NO₃^--N处理，表明杉叶藻对NH₄⁺-N的吸收利用效率较低。组织无机氮以NO₃^--N为主。通径分析显示，NH₄⁺-N处理下组织NH₄⁺-N含量对鲜重的直接通径系数最大（0.692），决策系数为-0.432；NO₃^--N处理下株高的直接通径系数最大（0.497），决策系数为0.378，根系活力、组织NH₄⁺-N和IN通过间接正效应促进鲜重积累。这表明NO₃^--N通过促进组织NH₄⁺-N形成和株高伸长来增加鲜重，而NH₄⁺-N则通过代谢毒性限制氮利用并抑制发育。

3.2 杉叶藻根系酶活性对氮形态的响应

3.2.1 氮转化相关酶活性

第40天，NO₃^--N处理下根系NR、NiR、GS和GOGAT活性均显著高于NH₄⁺-N处理。随环境NO₃^--N浓度升高，NR和GS总体呈U型变化，分别在NN5和NN10达到最小值；NiR呈倒U型变化，NN20达到峰值（27.04 mg g^-1 pro）。NH₄⁺-N处理下GOGAT呈U型变化，AN5达到最小值（48.70 μg g^-1 pro）。与N0相比，环境NH₄⁺-N在2–50 mg L^-1范围内均显著降低NR、NiR、GS和GOGAT活性，而NO₃^--N处理下部分酶活性显著升高。这表明NH₄⁺-N即使在2 mg L^-1的低浓度下也抑制根系氮代谢酶活性，而NO₃^--N能有效激活从吸收到同化的完整氮代谢途径，实现更高效的氮利用和积累。

3.2.2 抗氧化酶活性

NO₃^--N处理下根系MDA含量为1.38–3.05 nmol g^-1，明显低于NH₄⁺-N处理下的2.10–3.74 nmol g^-1。NO₃^--N处理下SOD、CAT和POD活性均高于NH₄⁺-N处理。随环境NO₃^--N浓度升高，MDA和POD呈下降趋势，CAT呈上升趋势；随环境NH₄⁺-N浓度升高，MDA、SOD、CAT和POD总体呈U型变化。与N0相比，NH₄⁺-N处理在2 mg L^-1时即显著降低SOD、CAT和POD活性。Pearson相关分析显示，NO₃^--N处理下环境NO₃^--N与MDA负相关，MDA与株高和鲜重显著负相关。通径分析表明，NH₄⁺-N处理下组织NH₄⁺-N对WGR的直接通径系数最大，NO₃^--N处理下组织NH₄⁺-N同样贡献最大的直接通径系数。NH₄⁺-N毒性通过MDA积累引发严重氧化损伤，直接损害膜完整性并抑制WGR和根长等生长指标；而NO₃^--N通过抑制MDA、维持膜稳定性来促进生长。NH₄⁺-N处理下MDA含量高而抗氧化酶活性相对较低，可能归因于NH₄⁺-N同化导致胞质pH降低引起酶变性失活，以及能量在铵解毒与ROS清除酶合成之间的竞争性分配。

3.3 杉叶藻生长激素对氮形态的响应

AN10和AN50处理下ABA含量显著高于N0、NN10和NN50，且随NH₄⁺-N浓度升高显著增加，NH₄⁺-N诱导ABA超积累（50 mg L^-1时为N0的9倍）。SA含量在NN10最高，随NO₃^--N浓度升高而降低。GA3在NN10和AN10中较N0显著降低，AN10显著高于NN10，且随NH₄⁺-N浓度升高而增加。四种生长素（ICA、IAA、IPA、IBA）在NH₄⁺-N和NO₃^--N处理下均较N0降低。ZR含量随氮浓度升高而增加，NN50和AN50达到最大值，NH₄⁺-N处理下ZR显著高于NO₃^--N处理，这可能与NO₃^--N诱导细胞分裂素（CTK）向地上部转运有关。N6-iPA和iPR含量随氮浓度升高而降低，NO₃^--N处理下降低更明显。DHJA在N0最低，随NH₄⁺-N升高而降低、随NO₃^--N升高而增加。JA-Ile在NO₃^--N处理下较N0显著增加，但随NO₃^--N浓度升高而降低；NH₄⁺-N处理下较N0降低，但随NH₄⁺-N浓度升高而增加。JA和MeJA的变化趋势与JA-Ile类似。DHJA、JA-Ile和JA在NO₃^--N处理下的含量显著高于NH₄⁺-N处理，表明NO₃^--N处理下杉叶藻表现出更强的胁迫耐受性。此外，NO₃^--N处理下根系NO信号浓度显著高于NH₄⁺-N处理。总体而言，NO₃^--N处理下杉叶藻可能抑制ABA合成、促进IAA和CTK向地上部转运以促进生长发育、增强JA及相关活性物质合成以提高抗逆性；NH₄⁺-N处理则增加ABA、SA和GA含量，加剧铵毒性，抑制JA和JA-Ile合成，导致抗逆性下降。

四、讨论与结论

讨论总结：该研究揭示了杉叶藻在低温条件下对不同氮形态的差异性响应涉及多层次的生理生化协同调控。在氮同化层面，NO₃^--N通过激活NR、NiR、GS和GOGAT的完整酶促途径，实现更高效的氮吸收、转化和积累；而NH₄⁺-N即使在低浓度下也抑制这些酶的活性，导致氮利用效率低下。在氧化平衡层面，NO₃^--N通过维持较高的抗氧化酶活性和较低的MDA水平保护膜完整性，而NH₄⁺-N则通过胞质酸化和能量竞争导致抗氧化系统崩溃和氧化损伤加剧。在信号调控层面，NO₃^--N增强根系NO信号，促进IAA和CTK的转运分配，上调茉莉酸类物质合成，形成促进生长与增强抗逆的协同网络；NH₄⁺-N则诱导ABA超积累，抑制茉莉酸相关响应，使激素平衡向胁迫适应倾斜，最终抑制根系发育和生物量积累。这些发现为理解耐冷水生植物在氮形态依赖性生长中的生理适应策略提供了系统证据。

结论翻译：该研究表明，杉叶藻在低温条件下表现出基于生长的对NO₃^--N优于NH₄⁺-N的偏好。当NH₄⁺-N供应量达到或超过10 mg N L^-1时，根系发育和生物量积累受到显著抑制，而NO₃^--N未引起类似的生长抑制。混合氮实验进一步支持了硝酸盐优势，因为在相同总氮供应下提高NO₃^--N比例可促进鲜重积累和重量增长率。这些结果确定了杉叶藻在低温条件下的氮形态偏好和铵态氮敏感性阈值。杉叶藻对NO₃^--N和NH₄⁺-N的差异性响应与氮同化、氧化平衡、NO信号和植物激素谱的协同变化密切相关。硝酸盐供应增强了NR、NiR、GS和GOGAT活性，促进组织氮积累，降低MDA积累，维持较高的抗氧化酶活性并增强根系NO信号。相反，高浓度NH₄⁺-N供应损害了氮利用，加剧氧化损伤并诱导ABA积累，同时与较弱的茉莉酸相关响应相关。总体而言，这些发现增进了对耐冷水生大型植物氮形态依赖性生理适应的理解，并为杉叶藻在硝态氮主导的冷季水体中的应用提供了实践依据，同时警示应避免在铵态氮富集环境中使用该物种。该论文发表于《Plant Physiology and Biochemistry》。