工程化烟草（Nicotiana tabacum L.）细胞培养中藏花素的生产：代谢表征、生物反应器培养与神经保护潜力

《Plant Physiology and Biochemistry》：Crocin production in engineered Nicotiana tabacum L. cell cultures: metabolic characterization, bioreactor cultivation and neuroprotective potential

　　

藏花素（crocins）是来源于番红花（Crocus sativus L.）的水溶性类胡萝卜素裂解产物（apocarotenoids），具有强效抗氧化和神经保护特性，但其供应受到低产量和劳动密集型栽培的限制。研究人员此前对烟草（Nicotiana tabacum L.）进行工程化改造，使其表达类胡萝卜素裂解双加氧酶2（carotenoid cleavage dioxygenase 2, CCD2），以建立替代生产平台。转基因株系以不同水平积累藏花素，其中包括一部分高产地基因型。然而，这些株系表现出黄化、生长受损和土壤存活率降低，凸显了藏花素生物合成与光合功能之间的权衡。为克服这一限制，研究人员随后选用筛选出的最佳表现株系建立愈伤组织培养，并在光照和黑暗条件下培养，使用纳米颗粒进行诱导，最终分析藏花素积累、类胡萝卜素前体谱以及关键生物合成基因的表达。代谢物与转录组数据的整合揭示了类胡萝卜素代谢与藏花素生产之间的复杂关系，表明藏花素积累可能不仅取决于基因表达，还取决于前体可利用性、翻译后效应、常规效应以及代谢流。为开发可规模化生产平台，研究人员将产量最高的株系转入悬浮培养，并首次在生物反应器系统中成功培养。该方法获得了以糖基化藏花素种类为主的藏花素富集提取物，展示了工程化烟草细胞培养用于可持续规模化藏花素生产的潜力。最后，来自生物反应器培养物的水醇提取物在人SK-N-BE神经母细胞瘤细胞系中未显示细胞毒性，并显著保护细胞免受过氧化氢诱导的氧化应激。总体而言，这些结果表明，工程化N. tabacum愈伤组织培养是规模化藏花素生产的有前景平台，并可能成为用于制药应用的生物活性类胡萝卜素裂解产物的潜在来源。

该研究发表于《Plant Physiology and Biochemistry》。藏花素（crocins）是番红花（Crocus sativus L.）柱头中积累的水溶性类胡萝卜素裂解产物，具有抗氧化和神经保护活性，但自然来源产量极低、栽培人工成本高，严重限制其供应。研究人员此前通过在烟草（Nicotiana tabacum L.）中稳定表达类胡萝卜素裂解双加氧酶2（CCD2）获得产藏花素植株，但这些植株表现出黄化、生长受抑和土壤存活率低等问题。为克服这些限制并实现规模化生产，研究人员以高产地转基因烟草株系为材料，建立愈伤组织、悬浮细胞和生物反应器培养的完整生产管线，结合代谢组学、转录分析和质谱成像，系统研究藏花素积累机制及其神经保护功能。

研究人员采用的主要技术方法包括：通过稳定遗传转化获得CCD2过表达烟草株系；从叶片外植体诱导愈伤组织并在光照/黑暗条件下培养；利用壳聚糖纳米颗粒负载β-紫罗兰酮（β-ionone）或β-环柠檬醛（β-cyclocitral）进行诱导处理；采用定量实时PCR检测CCD2、PSY、LCY-b和CHY基因表达；通过LC-HRMS靶向代谢组学定量藏花素和类胡萝卜素；利用DESI-HRMS质谱成像分析愈伤组织中藏花素的空间分布；选择最佳株系在5 L搅拌罐式生物反应器（STR）中进行悬浮培养；以人SK-N-BE(2)神经母细胞瘤细胞系（ATCC CRL-2271）为模型，结合MTT和台盼蓝染色评估提取物细胞毒性和抗氧化应激保护作用。

### 3.1 工程化烟草株系呈现差异化的藏花素积累与糖基化谱

通过分析独立转基因株系叶片中的藏花素含量，发现T2代总藏花素水平介于72.14±1.94至421.86±8.44 μg/g DW之间，其中L5 T2株系产量最高；T3代整体水平较低。高产株系富含高糖基化藏花素，如trans-crocin 3，而低产株系中低糖基化形式占比较高。该结果表明藏花素积累不仅取决于CCD2介导的裂解，还受内源糖基化效率影响。

### 3.2 光照调节CCD2OX愈伤组织藏花素积累与组成

将L5 T2、L1 T2、L1 T3和L2 T3株系诱导为愈伤组织后，所有转基因愈伤组织在光照条件下藏花素含量均高于黑暗条件，L5 T2光照下达到64.55±7.47 μg/g DW。DESI-HRMS成像在黄色愈伤组织区域检测到藏花素2、3、4的信号，证实藏花素在愈伤组织中真实积累。结果表明光照通过促进类胡萝卜素代谢而增强藏花素积累。

### 3.3 CCD2OX愈伤组织呈现广泛的类胡萝卜素重塑

与野生型愈伤组织相比，转基因愈伤组织中叶黄素、紫黄质和新黄质等下游叶黄素类化合物显著降低甚至消失，而八氢番茄红素、番茄红素和β-胡萝卜素等上游中间体在光照条件下有所积累。这证明CCD2表达将类胡萝卜素代谢流从叶黄素分支转向藏花素生物合成，并可能引发上游途径的反馈调节。

### 3.4 代谢物与表达谱整合揭示藏花素生物合成的复杂调控

qRT-PCR显示CCD2转录水平与藏花素含量无直接正相关，PSY和CHY表达虽受光照诱导但与产量也无简单对应关系。z-score标准化热图和皮尔逊相关矩阵表明，藏花素各组分间呈强正相关，叶黄素类与藏花素间呈弱负相关趋势。该结果说明藏花素积累由前体供应、代谢流重分配、反馈调节和下游糖基化共同决定，而非单一基因转录水平控制。

### 3.5 脱辅基类胡萝卜素诱导处理调节CCD2OX愈伤组织藏花素积累

研究人员制备了负载β-紫罗兰酮和β-环柠檬醛的壳聚糖纳米颗粒，两种化合物的包封率均较低，β-紫罗兰酮对壳聚糖基质亲和力更高。处理转基因愈伤组织后，藏花素积累总体下降，且效应因株系遗传背景而异。该结果表明在测试条件下，外源脱辅基类胡萝卜素信号分子会干扰类胡萝卜素稳态，减少可用于CCD2裂解的前体供应，从而抑制藏花素积累。

### 3.6 生物反应器培养的CCD2OX细胞维持藏花素生物合成与类胡萝卜素重塑

选择产量最高的L5 T2株系在5 L搅拌罐式生物反应器中培养，最终获得111.9 g FW/L（5.3 g DW/L）的生物量。生物反应器悬浮细胞总藏花素含量为87.30±6.91 μg/g DW，高于同一株系固体愈伤组织培养水平。藏花素谱以trans-异构体为主，trans-crocin 3和trans-crocin 4占比最高，说明糖基化过程在规模化培养中仍保持活跃。类胡萝卜素谱则富集番茄红素和β-胡萝卜素，缺乏下游叶黄素类，表明液体培养形成了有利于藏花素底物供应的独特代谢状态。

### 3.7 生物反应器来源的藏花素提取物保护SK-N-BE(2)细胞免受氧化应激

在50、100和200 μg/mL浓度下，生物反应器提取物对SK-N-BE(2)细胞均无细胞毒性。以150 μM过氧化氢（H₂O₂）诱导氧化损伤后，保护试验和共处理试验中提取物显著提高细胞活力，而恢复试验中未见明显修复作用。这表明提取物主要通过预防或限制氧化损伤发挥神经保护作用，而非修复已形成的损伤，其活性与藏花素及脱辅基类胡萝卜素的抗氧化特性相关。

讨论部分指出，CCD2在烟草中的稳定表达可使藏花素生物合成贯穿植株、愈伤组织、悬浮细胞和生物反应器培养全过程。不同转基因株系间的产量差异可能源于插入位置效应、拷贝数差异、表观沉默或转录后基因沉默。光照对藏花素积累的促进作用并非直接驱动35S启动子控制的CCD2转录，而是通过增强类胡萝卜素合成、质体发育和氧化代谢实现。生物反应器培养首次证明搅拌罐式系统可支持产藏花素植物细胞规模化培养，并保持糖基化藏花素谱和神经保护活性。研究结论表明，稳定表达CCD2使N. tabacum细胞培养成为可持续、可规模化的藏花素生产平台；藏花素生物合成在从转基因植株到愈伤组织、悬浮培养及搅拌罐式生物反应器的完整管线中均得以维持，生物反应器培养还能提高藏花素积累并保留提取物的神经保护活性且无细胞毒性，为高价值脱辅基类胡萝卜素的生物技术和制药应用奠定了基础。