褪黑素响应基因GhMYC5在棉花干旱耐受中的功能表征

《Plant Physiology and Biochemistry》：Functional characterization of melatonin-responsive GhMYC5 in cotton drought tolerance

　　

干旱胁迫对棉花产量和纤维品质构成严重制约。前期研究表明，外源褪黑素（melatonin, MT）处理能有效增强棉花的耐旱性。通过转录组测序和加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis, WGCNA），研究人员鉴定出GhMYC5——一个碱性螺旋-环-螺旋转录因子（basic helix-loop-helix, bHLH）——作为响应褪黑素、调控干旱应答的核心枢纽基因。为阐明GhMYC5的功能角色和分子机制，研究人员采用病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing, VIGS）技术抑制棉花中GhMYC5的表达，同时在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中构建异源过表达株系。表型和生理评估表明，沉默GhMYC5显著损害了棉花耐旱性。在干旱条件下，GhMYC5沉默植株的过氧化物酶（peroxidase, POD）和过氧化氢酶（catalase, CAT）活性、叶片相对含水量（relative water content, RWC）及脯氨酸（proline, PRO）积累量显著降低，而丙二醛（malondialdehyde, MDA）水平显著升高。相比之下，过表达GhMYC5的转基因拟南芥表现出增强的耐旱性。转录组分析在干旱胁迫下的GhMYC5沉默植株中鉴定出9,525个差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）。基因本体（Gene Ontology, GO）分析表明，这些DEGs主要与蛋白激酶相关的生物学过程有关。重要的是，与Ca2+信号、脱落酸（abscisic acid, ABA）和茉莉酸（jasmonic acid, JA）串扰以及丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）级联通路相关的关键基因和激酶均发生显著变化。综上所述，这些发现表明GhMYC5在棉花干旱胁迫响应中发挥正调控因子的作用，其调控机制与ABA、JA及MAPK信号通路密切相关。本研究为阐明棉花耐旱性的分子机制提供了新的遗传资源和理论基础，从而有助于耐旱棉花品种的培育。

**GhMYC5转录因子在棉花干旱耐受中的功能表征及调控机制研究——论文解读**

**一、研究背景与科学问题**

干旱胁迫是制约全球棉花产量和纤维品质的主要非生物逆境因子之一。转录因子作为基因表达的关键调控因子，能够整合多种上游信号并精确调控下游基因调控网络，从而影响植物生长发育和非生物胁迫响应。MYC基因家族是碱性螺旋-环-螺旋转录因子超家族的重要亚类，所有MYC蛋白均含有两个保守结构域：N端的bHLH-MYC_N结构域（负责转录激活和JAZ互作）和C端的bHLH结构域（介导与E/G-box顺式元件的DNA结合及蛋白二聚化）。已有大量证据表明，MYC转录因子广泛参与植物生长发育的多个方面，包括色素积累、茉莉酸介导的形态建成、光信号转导、昼夜节律调控、开花结实、种子成熟、木质素生物合成、次生代谢及激素串扰等。MYC蛋白还在植物对生物胁迫的防御中发挥关键功能。

在非生物胁迫耐受方面，ICE1型MYC基因通过调节木质素沉积和活性氧稳态提高耐寒性；SlMYC2和CoMYC2-like基因通过调控抗氧化能力、ROS稳态、植物激素信号和气孔运动增强耐旱性。然而，棉花MYC基因在干旱胁迫下的功能研究仍较为匮乏。已有研究主要集中于棉花MYC基因对昆虫和病原菌的生物防御功能，如GhMYC1374和MYC2-like转录因子GhGoPGF增强抗虫性。褪黑素作为一种保守的胁迫信号分子，可通过激活抗氧化系统、类黄酮生物合成、MAPK和ABA信号级联以及MYC介导的转录调控来缓解多种植物的干旱、盐和冷害损伤。前期转录组和WGCNA分析已鉴定出干旱诱导的GhMYC5（一个bHLH转录因子）作为褪黑素响应DEGs中的核心枢纽基因。在此背景下，本研究旨在系统解析GhMYC5在棉花干旱胁迫响应中的核心功能及其分子调控机制，丰富对棉花MYC家族基因功能的认知，并为耐旱棉花品种的分子育种提供遗传资源和理论基础。

**二、主要技术方法**

本研究采用多种关键技术手段。系统进化分析方面，利用BLAST在Phytozome数据库检索GhMYC5同源蛋白序列，采用MEGA 11.0中的邻接法构建无根系统发育树（1000次自举检验），并通过MEME在线工具鉴定保守功能基序，最终用TBtools整合可视化。基因功能验证方面，采用烟草脆裂病毒（TRV）双载体系统（TRV1+TRV2）对棉花进行VIGS基因沉默实验，以GhCLA作为阳性对照（其沉默可诱导白化表型）；同时构建pCAMBIA1301:GhMYC5过表达载体，通过花序浸蘸法（floral dip）生成异源过表达拟南芥株系。材料包括陆地棉（Gossypium hirsutum cv. Zhongmian 113）种子及野生型拟南芥Col-0。生理指标测定包括叶片相对含水量、脯氨酸和丙二醛含量、CAT和POD活性。转录组测序由武汉FASA Genomics公司完成，基于DNBSEQ-T7平台生成150 bp双端读长，利用HISAT2比对到陆地棉TM-1参考基因组，DESeq2鉴定差异表达基因（阈值：|FC|≥1.5，FDR校正p<0.05），并进行GO和KEGG功能注释。

**三、研究结果**

**3.1 GhMYC5的鉴定**

基于前期外源褪黑素显著提高棉花耐旱性的发现，通过转录组测序结合WGCNA分析，研究人员从干旱胁迫下褪黑素特异性诱导的DEGs中鉴定出编码bHLH转录因子的GhMYC5基因，将其确定为核心调控基因。qRT-PCR验证了转录组数据的可靠性。系统发育分析显示，GhMYC5与可可同源蛋白Thecc.01G335600.1.p形成紧密分支，亲缘关系最近。保守基序分析鉴定出10个不同的保守基序，GhMYC5与其近缘的可可和番茄同源蛋白具有相同的保守基序组成和排列顺序；单子叶MYC同源蛋白（水稻、玉米、大麦）独有基序9，而十字花科蛋白（AtMYC2、AtMYC5、油菜、盐芥）缺少基序9。作为bHLH转录因子IIIe亚组成员，MYC5与MYC2功能冗余，共同调控多种JA依赖的生物学反应。此外，整合分析干旱敏感型和耐旱型棉花品种的转录组数据发现，GhMYC5在干旱敏感型品种中干旱处理后表达不变，而在耐旱型品种中显著上调，表明GhMYC5可能参与调控棉花干旱胁迫响应。

**3.2 沉默GhMYC5损害棉花耐旱性**

采用VIGS技术抑制GhMYC5表达。阳性对照株系（TRV2:GhCLA）出现白化表型，验证了VIGS系统的有效性；qPCR分析确认TRV2:GhMYC5植株中GhMYC5表达较对照显著下调。干旱处理13天后，GhMYC5沉默植株表现出明显更严重的叶片萎蔫。生理指标测定显示，正常浇水条件下两组间RWC无显著差异；干旱胁迫下，对照植株RWC显著高于沉默植株。干旱条件下，TRV2:00植株的CAT活性、POD活性和PRO含量均显著高于TRV2:GhMYC5植株，而MDA含量显著低于沉默植株。正常浇水条件下两组抗氧化酶活性、PRO和MDA含量均无显著差异。这些结果表明，GhMYC5沉默不影响正常条件下的棉花生长和生理状态，但显著损害干旱胁迫下的水分保持能力和抗氧化防御能力，证明GhMYC5正调控棉花干旱胁迫响应。

**3.3 GhMYC5在转基因拟南芥中正调控耐旱性**

利用qPCR筛选出L1、L2和L3三个高表达转基因拟南芥株系。土壤干旱处理20天后，野生型植株遭受严重萎蔫和水分丧失，而GhMYC5过表达株系保持明显更健康的表型。生理评估显示，干旱胁迫下转基因株系的抗氧化酶（POD和CAT）活性、RWC和PRO含量显著升高，而MDA积累量显著降低。这表明野生型植株在水分子缺条件下遭受更严重的膜脂过氧化和氧化损伤。该结果与棉花中VIGS沉默GhMYC5降低耐旱性的结果形成“正-负双向验证”范式，进一步证实了GhMYC5在植物干旱胁迫响应中的正调控功能。

**3.4 GhMYC5异源表达赋予拟南芥增强的耐旱性**

在含有0、100、200、300 mmol/L甘露醇的1/2 MS培养基上评估种子根伸长。正常和轻度胁迫（100 mmol/L）条件下未检测到表型差异；在中度（200 mmol/L）和重度（300 mmol/L）渗透胁迫下，三个转基因株系的主根生长均显著优于野生型，证实了GhMYC5作为干旱适应正调控因子的功能。

**3.5 GhMYC5沉默影响的DEGs主要富集在蛋白磷酸化及相关生物学过程**

对干旱胁迫下的对照和GhMYC5沉默棉花进行转录组测序。质量控制显示Q30碱基比例在98.76%-99.02%之间，GC含量在44.62%-45.03%之间，数据质量高。DEGs鉴定结果显示，GhMYC5沉默诱导了9,525个基因的显著转录变化，其中3,347个上调，6,178个下调。随机选取10个DEGs进行qPCR验证，结果与转录组数据一致。GO富集分析表明，下调DEGs最显著富集在“蛋白磷酸化”和“DNA模板化转录调控”两个生物学过程，提示蛋白磷酸化和转录调控在GhMYC5介导的干旱响应中发挥广泛的调节作用。

**3.6 GhMYC5沉默干扰ABA、Ca2+、MAPK和JA信号通路**

在ABA信号通路方面，GhMYC5沉默导致多个编码NCED家族蛋白的基因（ABA生物合成限速步骤的关键催化酶）显著下调；同时诱导ABA信号通路负调控因子PP2Cs上调和正调控因子SnRK2下调，并抑制下游核心转录因子ABFs和Respiratory burst oxidase homologs（RBOHs）的转录积累。在Ca2+信号通路方面，编码CIPK、CPK和AKT蛋白激酶的基因广泛下调。在MAPK级联通路方面，级联各层级基因（MAP3K、MKK和MPK）均系统性下调，下游转录因子基因WRKY、MYB和ERF的表达也显著受抑。在JA信号通路方面，GhMYC5沉默后，JA信号正调控因子COI1和核心转录因子MYC2的转录水平显著降低，进而导致下游转录调控网络紊乱——编码褪黑素生物合成关键酶ASMT和COMT、JA生物合成关键酶LOX和AOS、转录因子ERF和NCED以及过氧化物酶基因（PER）的表达水平降低，而PP2C、查尔酮合酶（CHS）和B-ARR的转录积累。这些结果表明，GhMYC5沉默广泛破坏JA、ABA、Ca2+信号和MAPK级联等多条通路中蛋白磷酸化组分和下游转录因子的转录稳态，证实了GO富集分析揭示的“蛋白磷酸化”和“转录调控”生物学过程的协同紊乱。

**3.7 褪黑素介导的GhMYC5干旱胁迫响应**

对GhMYC5沉默棉花转录组进行KEGG富集分析，在硫胺素代谢通路中检测到5个Thi1编码基因和2个ThiC编码基因，在牛磺酸和次牛磺酸代谢通路中检测到2个含黄素单加氧酶1（FMO1）编码基因和1个γ-谷氨酰转肽酶（GGT）编码基因，与前期研究发现一致。这些结果提示，褪黑素可能通过上调GhMYC5来调控硫胺素代谢以及牛磺酸和次牛磺酸代谢通路，从而参与棉花干旱胁迫响应。

**四、结论与讨论总结**

本研究首次系统定义了bHLH转录因子基因GhMYC5在棉花干旱响应中的生物学功能。基因沉默和异源过表达实验双向验证了GhMYC5正向调控干旱耐受性。该研究首次报道了MYC型bHLH转录因子在陆地棉干旱响应中的明确作用，填补了MYC家族在棉花非生物胁迫中功能研究的关键空白。研究还发现GhMYC5是褪黑素增强棉花耐旱信号网络的核心下游枢纽，其沉默会破坏褪黑素相关的硫胺素及牛磺酸和次牛磺酸代谢通路；同时，GhMYC5可能作为整合节点，同时关联和调控ABA信号、Ca2+信号、MAPK级联和JA信号通路，协调多层次的干旱胁迫响应。这些发现为棉花耐旱调控网络提供了新见解，并为培育耐旱棉花品种提供了有前景的候选基因。