OsERFSR1的克隆与功能鉴定：水稻（*Oryza sativa* L.）盐胁迫耐受性的负调控因子

《Plant Physiology and Biochemistry》：Cloning and functional characterization of OsERFSR1, a negative regulator of salt stress tolerance in rice ( Oryza sativa L.)

　　

盐胁迫是限制水稻生长、发育和产量的主要非生物因素之一。本研究从水稻中克隆了AP2/ERF转录因子家族成员OsERFSR1。OsERFSR1的过表达（overexpression, OE）显著降低了水稻的耐盐性，存活率为53.2%，而野生型（wild-type, WT）为70.2%；而CRISPR/Cas9介导的敲除（knockout, ko）则显著增强了耐盐性，存活率为54.6%，WT为28.2%，表明OsERFSR1是盐胁迫耐受性的负调控因子。生理分析显示，在盐胁迫下，与WT植株相比，OE株系积累了显著更高水平的丙二醛（malondialdehyde, MDA）和过氧化氢（H₂O₂），但表现出较低的抗氧化酶活性和较慢的渗透调节物质积累。相反，ko株系则表现出相反的生理趋势。转录组分析鉴定出三种基因型之间的差异表达基因主要富集在色氨酸代谢和植物激素信号转导通路中。综上所述，研究人员的发现表明OsERFSR1与水稻的耐盐性相关，并可能通过色氨酸代谢和激素信号通路调节该过程，从而影响下游的抗氧化防御系统。该研究为通过基因编辑方法提高水稻耐盐性提供了一个有前景的候选靶基因。

**OsERFSR1负调控水稻盐胁迫耐受性的功能鉴定与机制解析**

土壤盐碱化是全球农业生产的重大威胁，影响范围超过十亿公顷土地。盐胁迫通过两条主要途径损害植物：一是土壤高盐浓度限制根系吸水，引发细胞脱水和渗透胁迫；二是钠离子积累干扰代谢过程并诱导程序性细胞死亡。转录因子作为能特异性结合真核基因启动子区顺式作用元件的蛋白分子，在植物生长发育和环境应答中发挥重要调控作用。其中AP2/ERF（APETALA2/乙烯响应因子）超家族是植物中最大的基因家族之一，参与多种生物学过程，尤其在对非生物胁迫的响应中扮演关键角色。水稻是全球约一半人口的主要能量来源，但盐胁迫严重制约其生长和产量。已有研究表明多个ERF转录因子参与植物耐盐性调控，但水稻中该家族成员OsERFSR1的功能尚不清楚。因此，克隆并鉴定OsERFSR1在水稻盐胁迫耐受性中的功能具有重要理论意义和应用价值。

研究人员从水稻中克隆了AP2/ERF转录因子家族成员OsERFSR1，通过过表达（OE）和CRISPR/Cas9介导的敲除（ko）双向遗传学验证，结合生理指标检测和转录组测序，系统揭示了OsERFSR1作为盐胁迫负调控因子的功能及其潜在分子机制。研究结果表明，过表达OsERFSR1显著降低水稻耐盐性，而敲除该基因则显著增强耐盐性，说明OsERFSR1在水稻盐胁迫响应中起负调控作用。该研究为通过基因编辑改良水稻耐盐性提供了候选靶基因。论文发表在《Plant Physiology and Biochemistry》。

本研究采用的主要技术方法包括：以粳稻品种Taipei 309为材料，利用InterPro数据库进行保守蛋白结构域分析和PlantCARE数据库预测启动子顺式元件；通过农杆菌介导的烟草叶片表皮细胞瞬时表达系统进行亚细胞定位分析；利用酵母系统检测转录激活活性；构建启动子-GUS融合表达载体分析组织表达模式；分别构建CaMV 35S启动子驱动的过表达载体和CRISPR/Cas9敲除载体，经农杆菌介导转化水稻获得转基因株系；运用qRT-PCR验证基因表达量；利用Illumina NovaSeq 6000平台进行转录组测序（由武汉迈特维尔生物科技有限公司完成），对差异表达基因进行GO和KEGG富集分析；检测MDA、H₂O₂、脯氨酸、可溶性糖含量及超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）活性等生理指标。

**OsERFSR1属于AP2/ERF转录因子家族**：通过克隆获得OsERFSR1基因开放阅读框（ORF）长1017 bp，编码338个氨基酸残基；InterPro保守结构域分析表明其含有典型的AP2/ERF结构域，确认为AP2/ERF转录因子家族成员。

**OsERFSR1定位于细胞核并具有自激活活性**：构建OsERFSR1-eGFP融合表达载体在烟草下表皮细胞中瞬时表达，激光共聚焦显微镜观察显示绿色荧光信号与核定位标记基因（拟南芥HY5）的红色荧光信号完全重叠，证明OsERFSR1蛋白定位于细胞核；酵母转录激活实验表明，OsERFSR1全长（1-338 aa）及含有C端区域（115-338 aa和175-338 aa）的截短片段均能在SD/?Trp/?His/?Ade培养基上正常生长并使菌落变蓝，而空载体对照不能生长，说明OsERFSR1具有强转录激活活性，其C端（175-338 aa）为转录激活结构域。

**克隆OsERFSR1启动子、顺式元件分析及组织表达模式鉴定**：从野生型水稻基因组中克隆了1790 bp启动子序列；PlantCARE分析发现该启动子区含有光响应元件、植物激素响应元件（脱落酸响应元件ABRE、茉莉酸甲酯响应元件TGACG-motif/CGTCA-motif等）、生长发育相关元件以及胁迫响应元件；GUS组织化学染色显示，ProOsERFSR1驱动的GUS信号在水稻根、茎、叶和颖壳中检测到，而胚乳和花药中无明显活性。

**过表达OsERFSR1降低转基因水稻耐盐性**：qRT-PCR证实OE株系中OsERFSR1表达量较WT提高4.16–4.25倍；在1/2 MS培养基含300 mM NaCl条件下，OE株系幼苗平均株高为1.4–1.5 cm、根长为0.8–0.97 cm，均显著低于WT（株高2.5 cm、根长2.2 cm）；土壤培养条件下经200 mM NaCl处理7天，OE株系存活率为53.2%，显著低于WT的70.2%。

**敲除OsERFSR1赋予转基因水稻耐盐性**：通过CRISPR/Cas9技术获得两个独立纯合敲除株系（ko-1和ko-2），Sanger测序确认均携带移码突变；在250 mM NaCl处理8天后，ko株系平均存活率达54.6%，显著高于WT的28.2%。

**敲除OsERFSR1增强抗氧化能力，而过表达抑制抗氧化防御**：盐胁迫下，OE株系中MDA和H₂O₂含量较WT增加更显著，而脯氨酸、可溶性糖积累及SOD、POD、CAT活性上升较WT慢；ko株系则呈现相反趋势，MDA和H₂O₂增幅显著低于WT，渗透调节物质和抗氧化酶活性上升更迅速。三种基因型耐盐性排序为ko>WT>OE。

**WT、OE和ko植株响应盐胁迫的转录组分析**：对三种基因型在盐处理前后进行转录组测序，经维恩图分析鉴定出叶片和根中分别有18个和17个重叠差异表达基因；KEGG富集分析显示这些基因主要富集在色氨酸代谢、植物激素信号转导、酪氨酸代谢、丝氨酸和苏氨酸代谢、吲哚生物碱生物合成、苯丙氨酸代谢、乙醛酸和二羧酸代谢、碳代谢、植物MAPK信号通路及次生代谢物生物合成等通路；GO富集分析表明差异表达基因主要涉及细胞组分（细胞、细胞部分、膜）和分子功能（催化活性、结合）；通过qRT-PCR验证12个差异表达基因的表达模式与转录组数据基本一致，证实转录组数据可靠。

讨论部分指出，OsERFSR1启动子含有ABA和MeJA响应元件，提示其可能通过ABA和JA信号通路响应盐胁迫。在盐胁迫下，OE株系中MDA和H₂O₂大量积累，而渗透调节物质和抗氧化酶活性上升缓慢，导致氧化损伤加剧、耐盐性降低；ko株系则相反。活性氧（ROS）水平与植物胁迫耐受性负相关，OsERFSR1可能通过抑制下游抗氧化酶编码基因的表达来削弱ROS清除能力。转录组分析显示差异表达基因富集于色氨酸代谢和植物激素信号转导通路，色氨酸作为生长素（IAA）和抗氧化化合物的前体，可增强细胞膜稳定性并维持激素和离子稳态，表明OsERFSR1可能通过调控色氨酸代谢和激素信号通路影响下游抗氧化系统。研究也指出存在的局限性，包括未检测OsERFSR1在不同组织不同时间点的动态表达模式，未定量盐胁迫下内源激素（ABA、JA、IAA）含量，未来需要通过ChIP-seq或DAP-seq鉴定OsERFSR1的直接靶基因，并在田间条件下验证突变体的耐盐表型。

研究结论方面，本研究从水稻中克隆并功能鉴定了新的AP2/ERF转录因子基因OsERFSR1。OsERFSR1编码定位于细胞核的蛋白并具有转录激活活性，其C端区域（第175–338位氨基酸）被鉴定为转录激活结构域。OsERFSR1的过表达显著降低了水稻的耐盐性，而该基因的敲除则显著增强了耐盐性，表明OsERFSR1可能作为盐胁迫耐受性的负调控因子，但其功能仍需进一步验证。生理分析显示，在盐胁迫条件下，OE株系中MDA和H₂O₂含量升高，而抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性和渗透调节物质（脯氨酸、可溶性糖）积累速率均低于WT植株。相反，ko株系表现出相反的生理趋势。转录组测序鉴定出三种基因型间的差异表达基因，主要富集在色氨酸代谢和植物激素信号转导通路，提示OsERFSR1可能通过调控这些通路负调节水稻耐盐性，从而影响抗氧化防御系统。综上所述，研究人员的发现表明OsERFSR1可能是水稻耐盐性的负调控因子，该基因的进一步功能鉴定将为通过遗传工程或基因编辑方法提高水稻耐盐性提供候选靶标。