《Plant Stress》：MicroRNAs (miRNAs) and small interfering RNAs (siRNAs) both contribute to wheat (Triticum aestivum L.) adaptation to continuous cultivation
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摘要
连作后的小麦产量下降是全球小麦生产的主要制约因素。这种产量下降被认为源于小麦与其（土壤）环境中胁迫因子之间的复杂互作，但明确的因果解释仍难以捉摸。在本研究中，研究人员证明了小非编码RNA（small non-coding RNAs，sRNAs）参与其中。
摘要
连作后的小麦产量下降是全球小麦生产的主要制约因素。这种产量下降被认为源于小麦与其（土壤）环境中胁迫因子之间的复杂互作，但明确的因果解释仍难以捉摸。在本研究中，研究人员证明了小非编码RNA（small non-coding RNAs，sRNAs）参与其中。多组学分析和实验验证揭示，小麦连作显著改变了sRNA的表达。研究结果表明，microRNA（miRNA）介导的转录后基因调控和24-nt小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）介导的DNA甲基化共同影响不同的分子和生理过程。因此，大多数被sRNAs下调的基因及其相关通路主要与叶片中的代谢和光合作用以及根系中的养分吸收相关，而参与生物/非生物胁迫应答的基因表达水平则有所增强。研究人员还强调了多个miRNAs和siRNAs协同调控这些基因和通路，可能影响小麦的生长-防御权衡。结果表明，连作改变了这一权衡，使植物将更多资源和能量用于应对栽培诱导的胁迫而非生长和发育，最终影响产量形成。这些结果，尽管其功能模式仍有待阐明，但连同候选基因和组学数据，为小非编码RNA在小麦适应不同耕作制度和环境胁迫中的作用提供了新的见解，并为提高小麦的恢复力、生产力和适应性（如通过分子育种）提供了新的候选靶标。
**论文解读：小麦连作适应中的miRNA与24-nt siRNA协同调控机制**
**一、研究背景与科学问题**
小麦（*Triticum aestivum* L.）是全球重要的粮食作物，其异源六倍体基因组使其能适应不同气候条件下的栽培。然而，当前集约化农业中普遍存在的小麦连作（monoculture）导致产量显著低于轮作体系，产量下降已成为全球小麦生产的主要制约因素。以往研究表明，连作障碍涉及土壤退化、土传病原菌积累、根际微生物群落失衡以及根系自毒物质释放等多重因素及其复杂互作，但其分子机制尚不清楚。
植物非编码小RNA（sRNA）包括miRNA和siRNA，是植物生长发育及胁迫响应的重要调控因子。miRNA通过转录后基因沉默（PTGS）调控靶基因表达，而24-nt siRNA主要通过RNA指导的DNA甲基化（RdDM）途径介导转录基因沉默（TGS）。此前连作相关研究仅有少数报道涉及miRNA，而siRNA尤其是24-nt siRNA在作物对连作适应中的作用尚未被探索。基于此，研究人员假设非编码sRNA通过重编程影响植物发育、防御响应和最终产量的分子及生理过程，参与小麦对连作栽培的适应。
该研究论文发表在《Plant Stress》。研究团队利用德国Harste长期轮作试验（2005年建立），对比连作小麦（WM）与轮作小麦（W1，油菜后茬）的旗叶和根系组织，通过多组学整合策略揭示了sRNA介导的小麦连作适应机制。
**二、主要技术方法**
研究人员采集旗叶和根系样本（拔节期EC31），构建12个mRNA文库和12个sRNA文库进行Illumina高通量测序，并进行全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）。差异miRNA和mRNA用DESeq2分析，差异24-nt siRNA cluster用edgeR分析，差异甲基化区域（DMR）用Metilene鉴定。miRNA靶基因用psRNATarget预测，24-nt siRNA靶基因通过DMR与差异siRNA共定位确定，结合基因本体（GO）富集分析、wGRN基因调控网络分析、重亚硫酸盐PCR测序（BSP）和RT-qPCR进行验证。
**三、研究结果**
**1. 通过深度测序鉴定小RNA**
sRNA测序显示叶片中以22-nt sRNA为主，根系中以21-nt sRNA为主；WM与W1之间21、22和24-nt sRNA的相对丰度发生改变，提示这些sRNA可能参与作物对不同耕作制度的响应。
**2. 差异表达miRNA的鉴定**
共鉴定出495个已知miRNA（隶属149个家族）和16个新miRNA。差异表达分析获得17个差异表达miRNA（DE-miRNA），隶属10个家族。叶片中以下调为主，根系中以上调为主。miR1432是唯一在叶片和根系中均一致下调的miRNA，提示其可能作为协调地上部和地下部响应的关键分子。RT-qPCR结果与测序数据一致。
**3. 差异表达24-nt siRNA cluster的鉴定**
在叶片和根系中分别获得55,465和38,418个24-nt siRNA clusters，约8%在WM与W1之间显著差异表达，根系中89%上调。通过DE-24-nt siRNA与DMR共定位及方向一致性分析，在叶片和根系中分别筛选出425个和366个候选RdDM位点，超过80%与转座子（TE）相关，均匀分布于基因区和基因间区。
**4. DE-miRNAs和DE-24-nt siRNAs的靶基因预测与分析**
17个DE-miRNAs预测到2,045个潜在靶基因，多为转录因子（TF），如miR159靶向MYB家族、miR396靶向GRF家族。459个基因被预测为DE-24-nt siRNAs的潜在靶标。GO富集分析显示，叶片中miRNA靶标富集于转录调控，siRNA靶标富集于激素信号通路；根系中miRNA靶标涉及囊泡运输和养分转运，siRNA靶标则富集于植物免疫应答。
**5. 候选调控靶基因的鉴定**
将预测靶标与转录组差异表达基因（DEG）取交集，发现71个（3.5%）miRNA预测靶标和27个（5.9%）siRNA相关基因与DEG重叠。叶片中多数重叠DEG在WM中上调，根系中多数下调。代表性示例包括：上调的miR159靶向光合相关基因PPD5；上调的24-nt siRNAs沉默参与光系统II和叶绿素生物合成的LPA1和CHLP；下调的miR1432、miR398和miR408激活OXO2、PER55、CIPK15、RPM1等胁迫响应基因。BSP实验独立验证了CHLP和SDF2位点的甲基化模式。
**6. 四个转录因子的基因调控网络分析**
wGRN分析确定了C3H12、MYB30、MYB94和NAC41四个TF作为sRNA介导调控网络的核心节点。C3H12（miR159靶标）调控光合相关基因LPA1和CHLP；MYB30/94（miR528靶标）连接蜡质合成基因GL1-2等下游靶标；NAC41（miR5048靶标）调控碳固定基因CP21。功能注释表明这些TF网络分别涉及光合途径、蜡质生物合成与免疫、以及脱落酸（ABA）信号、硝酸盐吸收和水运输。
**四、讨论与研究结论**
讨论部分指出，连作小麦产量显著低于轮作小麦。sRNA在叶片和根系中的差异性响应模式提示根系sRNA的升高可能反映植物对连作改变的土壤和根际环境的早期响应。miR1432的一致下调使其成为协调地上/地下响应的候选分子。尽管24-nt siRNA丰度与全基因组DNA甲基化之间仅存在弱正相关（R约0.1），但DE-24-nt siRNA与DMR共定位分析仍鉴定出大量候选RdDM位点，且高度富集TE，体现了24-nt siRNA在维持基因组稳定性中的保守功能。
研究结论表明：miRNAs靶向C3H12、MYB30/94和NAC41等转录因子，调控下游生长与防御权衡相关基因；24-nt siRNAs通过RdDM介导DNA甲基化，在特定位点调控基因表达并维持基因组稳定性。以LPA1、CHLP和GL1-2为范例，连作栽培通过激活sRNA介导的PTGS和TGS机制，重新调整小麦的生长-防御权衡，使植物将更多能量和资源投入防御响应而非生长发育，最终影响产量形成。这些发现为理解小非编码RNA在小麦适应不同耕作制度和环境胁迫中的作用提供了新见解，也为通过分子育种改良小麦的抗逆性、生产力和适应性提供了候选基因和组学数据资源。
