《Plant Stress》：Endophytic Fungi in Grasses: Panomics-Driven Mechanisms of Combined Abiotic Stress Tolerance and Climate-Smart Pasture Improvement
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禾草相关的内生真菌建立了大部分无症状的关系，这些关系沿着由宿主基因型和环境塑造的互利-拮抗连续谱分布。Epichlo?物种（包括无性型的Neotyphodium形态）是冷季型禾草中广泛存在的系统性共生体，它们在细胞间生长，跟随宿主发育，并常感染生殖组织以便通过
禾草相关的内生真菌建立了大部分无症状的关系，这些关系沿着由宿主基因型和环境塑造的互利-拮抗连续谱分布。Epichlo?物种（包括无性型的Neotyphodium形态）是冷季型禾草中广泛存在的系统性共生体，它们在细胞间生长，跟随宿主发育，并常感染生殖组织以便通过种子进行垂直传播。本综述综合了禾草内生真菌多样性与生物地理学，包括麦角菌科（Epichlo?/Neotyphodium）、暗色有隔内生真菌和非麦角菌科类群，并评估了在气候、宿主特性、植物发育阶段和管理实践的环境过滤下它们的群落组装过程。共生关系通过多层机制维持，这些机制平衡了宿主免疫调节、氧化还原/活性氧稳态、激素介导的生长与防御权衡、次级代谢（如生物碱）以及微生物组重塑过程。研究人员整合了病原体和食草动物抑制与对单一非生物胁迫的增强耐受性，并批判性地评估了关于干旱-盐分和干旱-高温联合胁迫的新兴证据。在个体和联合胁迫情境下，反复出现的与内生真菌相关的响应包括渗透调节、抗氧化能力和离子稳态。整合基因组学、转录组学、代谢组学和比较基因组学信息的泛组学方法能够识别与胁迫适应相关的生物合成基因簇（BGCs）、分泌蛋白、转运蛋白和调控网络，并支持候选性状的功能验证优先排序。然而，人工智能/机器学习辅助的性状预测、基因编辑靶点优先排序以及田间可应用的育种应用仍处于前瞻阶段，需要严格的功能验证和多环境验证。本综述最后强调了转化应用的机会，同时指出了与田间一致性、家畜安全性和生态生物安全性相关的局限性。未来的优先事项包括泛组学指导的田间验证、合成生物学、微生物组工程以及经过仔细验证的预测性育种策略，以应对气候变化下恢复力强的草地系统。
1. 引言
牧场和饲用禾草是全球畜牧业的基础，对粮食安全和生态稳定至关重要。然而，其生产力和持久性日益受到单独发生和共同发生的非生物胁迫（包括干旱、盐分、高温及其组合，如干旱-盐分和干旱-高温）以及因气候变化而加剧的生物胁迫（病原体和昆虫植食）的限制。实现这些系统的可持续集约化需要创新策略，通过泛组学引导的育种和基于微生物组的解决方案来增强内在恢复力。与禾草相关的内生真菌，它们无症状地定殖于植物内部组织，代表了应对这一挑战的强大生物资源。这些共生体，特别是冷季型禾草中的系统性Epichlo?物种（包括无性型Neotyphodium形态），能深刻影响宿主的生理和生态。它们通过种子垂直传播的能力使其能在世代间延续共生，成为植物表型的一个可遗传组分。越来越多的证据表明，内生真菌感染可以增强宿主对多种胁迫的耐受性，通过生物碱产生驱避食草动物，并抑制病原体，从而以情境依赖的方式促进牧场的恢复力。禾草-内生真菌共生的有益结果是由复杂的分子对话介导的，包括宿主免疫反应的精细调控、氧化还原稳态的维持、植物激素信号的调节以及多种次生代谢产物的产生。近年来多组学和泛组学的进展，结合微生物组研究，已经开始揭示这些相互作用背后的遗传基础和调控网络；将生物合成基因簇和分泌效应因子与特定功能表型联系起来，可能有助于通过人工智能/机器学习辅助的方法进行候选性状优先排序和未来预测建模，尽管功能验证仍然必不可少。此外，内生真菌协调宿主的关键生理适应性，例如通过渗透保护剂积累进行渗透调节、增强抗氧化防御以及在盐分条件下调节离子转运蛋白活性。尽管有这些深入的机理认知，但在基础理解和可靠的农业应用之间仍存在显著差距。共生的功能结果高度依赖于情境，受宿主基因型、真菌菌株、环境条件和管理实践的影响。目前缺乏一个统一的框架来综合各类禾草内生真菌类群，包括麦角菌科、暗色有隔内生真菌和非麦角菌科分类单元，以及它们在复合非生物胁迫下对多重胁迫恢复力的整合作用。此外，这些共生体的实际部署必须谨慎处理与田间一致性、家畜安全性（尤其是来自生物碱的毒性）和生态生物安全性相关的挑战。与以往主要强调特定内生真菌类群、单个胁迫响应或孤立分子机制的综述不同，本综述将生态多样性、基于泛组学的发现、复合胁迫生物学和转化应用的局限性整合到一个统一框架中，用于理解和应用禾草-内生真菌相互作用。本综述旨在通过提供系统导向的当前知识综合来弥合这些差距。研究人员首先整合了禾草内生真菌的全球多样性和生物地理模式，审视了塑造其组装的生态过滤器。然后从分子到生理水平整合机理理解，强调通过泛组学启发的见解，免疫调节、代谢物产生和胁迫适应之间的相互作用。进一步区分在单个胁迫下获得的证据与直接评估复合或顺序胁迫组合的研究，并批判性地评估在干旱-盐分和干旱-高温条件下，与内生真菌相关的保护性反应是否仍然有效。通过将最近的泛组学进展和功能遗传学研究与农艺相关性状联系起来，评估内生真菌增强牧场恢复力的潜力，同时认识到基因编辑应用需要进一步的功能验证和生态评估。最后，批判性地评估安全有效部署的途径，确定未来研究的优先事项，包括人工智能辅助的候选共生体优先排序、复合胁迫场景下的田间验证以及负责任的生物工程。
2. 禾草内生真菌的多样性、分布和功能分化
与禾草相关的内生真菌在分类上是异质的，其相互作用分布在一个光谱上，范围从紧密协同进化的共生到更具机会主义和环境选择的相互作用。研究最深入的是Epichlo?属（及其被称为Neotyphodium的无性型等价物），它们与众多冷季型禾草形成系统性的长期关系，并通常通过种子进行垂直传播。除了Epichlo?，暗色有隔内生真菌（DSE）是一个功能性真菌类群，主要由子囊菌门菌丝组成，其特征是在禾草根部普遍定殖的具黑色素、有隔膜的菌丝。DSE在草地生态系统中广泛分布，通常与植物营养获取和抗逆性增强有关，尽管这些效应可能取决于情境。与此观点一致，根部内生真菌文献强调，许多广泛分布的无孢型内生真菌含有黑色素化的有隔菌丝，因此被归类为DSE功能群。此外，各种非麦角菌科属，如镰刀菌属、枝顶孢霉属和枝孢属，也已被重新分离为非症状的禾草内生真菌，突显了禾草内生真菌是一个生态类群的异质性集合。这些主要的内生真菌类群及其在不同气候区域的大尺度地理格局，即种子传播的Epichlo?相对于主要是根部定殖的DSE和其他属，在图1中进行了总结。该地图是基于已发表的关于禾草-内生真菌关联及其报道的生态分布信息的作者概念性综合，遵循类似的基于文献的方法来总结全球内生真菌发生模式。该框架为在泛组学引导的气候智能型牧场改良育种中针对特定内生真菌类群奠定了基础。暗色有隔内生真菌以内生方式定殖根部，这主要是局部性的，并从土壤中水平获得，这与系统性的且通常种子传播的Epichlo?形成对比。它们具黑色素的有隔菌丝，以及在某些类群中的微菌核样结构，可能支持其在干旱、盐分、养分限制和其他土壤胁迫下的持久性。报道的功能效应包括改善根部养分获取、水分关系、渗透调节和抗氧化保护。然而，这些效应高度依赖于基因型，并受真菌菌株、土壤性质和环境影响，其分子机制在Epichlo?模型中比在多样化的禾草内生真菌系统中更为了解。非麦角菌科内生真菌，包括镰刀菌属、枝顶孢霉属和枝孢属的菌株，代表了在分类和功能上异质的群体，通常表现出局部定殖和主要为水平传播。选定的菌株可能通过植物激素产生、养分动员、铁载体活性、水解酶、生态位竞争和次生代谢产物产生来促进宿主生长或抑制病原体。然而，这些属也包含致病性或条件致病性成员；因此，它们的功能解释和农业部署必须在菌株水平上进行评估。这些生态和生物学差异表明，在系统性Epichlo?关联中看到的机制不应简单外推到所有禾草-内生真菌关联。禾草内生真菌的分布在全球范围内非常动态，并受气候、宿主多样性和传播模式的塑造。这些内生真菌在冷季型牧草中尤为常见，包括高羊茅和多年生黑麦草，在这些植物中，它们有助于驱避食草动物和抵抗非生物胁迫，从而影响牧场表现。然而，即使在温带系统中，Epichlo?对宿主的覆盖也是不均衡的。例如，拂子茅属在全球约有250个种，但仅有部分被采样，约18个种被报道受感染，这表明宿主相容性可能对定殖施加了强烈限制。另一方面，在一些宿主中，在其原生范围内观察到高内生真菌感染频率。在其原生欧亚分布区，林地短柄草据报道几乎普遍感染了Epichlo? sylvatica，这是一个稳定的宿主种群和良好的内生真菌传播环境如何导致高内生真菌水平的例子。这类紧凑的贡献代表了旨在解码抗逆性遗传和代谢基础的泛组学研究的显著模型。热带和亚热带草原的内生真菌群落可能更多由非麦角菌科类群主导，例如DSE和其他根部相关内生真菌，并且经历比系统性Epichlo?更精细的空间周转，后者受到高强度的环境过滤和时空动态影响。温暖地区根部相关类群的主导作用与充分研究的温带和种子传播的Epichlo?系统相比，突显了内生真菌组装模式的一个重要差异。在一项基于培养和显微镜支持的对林地禾草Festuca gigantea根部的调查中，约40%的根部发现了真菌结构，并培养了六种内生真菌物种。禾草根部内生真菌，特别是在羊茅属及相关禾草中，相对于广泛研究的叶部Epichlo?/Neotyphodium共生而言，仍然认识不足。这种不平衡造成了基于地上调查的多样性和分布综合知识的重大空白。定殖频率和群落结构受多个相互作用因素的影响，包括宿主物种特性、植物发育阶段、遗传背景以及环境因素，如土壤性质、养分有效性和气候。内生真菌的分布也可能因农业管理措施而改变，这些措施可以改变宿主生理和周围的接种库。最值得注意的是，方法论决策对鉴定出的分类单元以及由此推断的分布模式可能有强烈影响。总的来说，这些相互作用的生物、生态和方法论力量塑造了内生真菌的地理和宿主特异性模式。
3. 禾草-内生真菌共生机制：作为最佳解析模型的Epichlo?
禾草与内生真菌之间的共生可以被概念化为一个受控的多层对话，其中真菌以最小损害定殖宿主组织，同时可能提高宿主适应性。最著名的例子是Epichlo?，它在细胞间生长并使其生长与宿主发育相协调。这种生长模式限制了组织干扰并支持宿主功能的维持，这对于真菌的长期存续至关重要，因为其依赖于宿主的生存和竞争力。由于分子调控在Epichlo?-禾草关联中被表征得最为详尽，本综述以Epichlo?作为主要的机理模型；在可获得的情况下纳入来自DSE和其他非麦角菌科内生真菌的证据，但这些机制不应假定在所有内生真菌类群中统一适用。兼容性定殖的关键机制之一是共生界面处活性氧和氧化还原稳态的调控。在互惠内生真菌中，活性氧不仅是抗菌物质，还充当发育信号，可以协调与宿主组织兼容的菌丝生长模式。成功的共生的特征是受约束且空间有序的真菌生长以及受调控的氧化信号，而非侵略性入侵。宿主植物在定殖过程中修饰抗氧化和胁迫响应途径的能力也促进了稳定共存，并防止了过度的防御相关损伤。内生真菌通过宿主模式触发免疫被感知，其中基础免疫信号被激活，但受到调控以防止在无症状定殖期间产生过度的系统性防御反应。模式触发免疫输出并非孤立运作，而是与激素网络相互作用，因为水杨酸/茉莉酸/乙烯信号传导与模式触发免疫调控的防御校准和定殖界面的氧化还原调节高度连接。这种相互作用为在多组学研究中观察到的Epichlo?相关禾草的激素重编程提供了机制基础，其中脱落酸、生长素、细胞分裂素、茉莉酸、水杨酸和乙烯途径的条件特异性调控有助于协调宿主兼容性和生长-防御平衡。总之，模式触发免疫连接的免疫校准和激素信号串扰可被视为一个整合的控制模块，协调受约束的真菌生长与宿主胁迫生理学及生长防御优先级。总体而言，免疫氧化还原校准作为一个门控层，允许细胞间存续，同时避免破坏组织的定殖。这一点很重要，因为响应胁迫的生长防御权衡的整合取决于宿主和内生真菌的优先级。在一些宿主系统中，Epichlo?的存在已在经验上与干旱期间光合效率和碳维持的增加相关联，这是共生体在水短缺期间稳定碳经济的一个特征。除了代内相容性，许多Epichlo?关联通过宿主繁殖得以稳定。在大多数Epichlo?-禾草关联中，共生通过种子垂直传播维持，真菌存续与宿主繁殖之间的关联有利于长期的低损害定殖策略。在此框架内，Epichlo?通过菌株特异性的生物碱生物合成在化学生态学中发挥重要作用，包括波拉明、洛林碱、麦角生物碱、吲哚二萜类化合物，这些物质可以驱避食草动物并间接支持宿主生存和内生真菌存续。因为这些代谢物依赖于真菌的生物合成能力和宿主资源，它们代表了该关联的综合代谢输出。除了直接的防御机制，Epichlo?还可以通过改变叶面微生物群落以及地下根际和丛枝菌根真菌相关过程来影响更广泛的植物-微生物相互作用，从而有助于提高胁迫恢复力。总的来说，这些研究表明禾草-内生真菌共生是通过以下方式建立和维持的：（i）受调控的定殖和协调生长；（ii）受调控的免疫和氧化还原调节；（iii）基于激素的生长防御权衡调控；以及（iv）基于代谢物的防御和微生物组重塑。
4. 内生真菌在复合非生物和生物胁迫下的胁迫耐受作用
4.1. 生物胁迫：病原体抑制和食草动物驱避
植物面临持续的生物威胁，如真菌/细菌病原体、昆虫和线虫。真菌内生真菌可以通过直接拮抗和间接免疫介导的防御来减少这些损失。病原体抑制是第一层保护。多种内生真菌产生抗真菌或抗菌的次生代谢物，并积极分泌水解酶，限制病原体发展，破坏病原体细胞壁或侵染结构。生态竞争可以加剧这些效应，因为内生真菌可以占据宿主组织内的感染相关生态位。它们还可以争夺空间和碳资源，并可能通过铁螯合的铁载体限制病原体对微量营养素的获取。这些机制在作物系统中已有广泛报道，并支持将内生真菌开发为可持续的生物防治剂。第二层防御是诱导抗性和防御启动。它可能导致诱导系统抗性或启动效应，其中防御机制在面对真正的病原体攻击时更容易被触发。毛癣菌也被发现能抑制立枯丝核菌并在番茄中诱导系统性抗性相关反应，支持其在控制土传病害方面的效用。这些诱导系统抗性结果的共同含义是它们涉及调节防御信号网络、加强物理/化学屏障以及激活植物抗氧化系统，从而限制病原体的扩散。植物还因内生真菌而进一步增强了对昆虫植食的抗性，这在禾草-内生真菌共生中很常见。Epichlo?属的内生真菌能够通过作为威慑物或通过有毒生物碱来提高抗性，从而减少昆虫的取食和存活。值得注意的是，保护作用不仅仅是生物碱的产生，还包括生物碱在植物中积累的部位：洛林碱的分布已被证明具有移动/转运的模式，并且它们与不同禾草宿主中蚜虫和其他昆虫表现的关系密切相关。这是一个有效的模型系统，可用于解释内生真菌来源的化学物质能够系统性作用并提供可量化的害虫抑制。生物抗性的进一步发展可能发生在群落层面。内生真菌可能重塑局部微生物群落，有时富集有益类群，并改变代谢组部分的代谢物环境，从而降低疾病严重程度。虽然因果宿主途径因宿主-内生真菌组合而异，但总体思路是内生真菌可以调节植物生理学以及相关微生物组，形成多层抗性，这可能比有针对性的化学防治更具抵抗力。这些生物胁迫缓解途径可分为直接拮抗/竞争、免疫启动、食草动物驱避和微生物组水平效应。在选定的非麦角菌科内生真菌中也报道了类似的拮抗功能，包括镰刀菌属、枝顶孢霉属和枝孢属的非致病性菌株，尽管它们的功效和生物安全性仍然强烈依赖于菌株。尽管有大量证据支持内生真菌介导的对食草动物和病原体的防御，但证据强度和功能验证在不同的内生真菌系统中有所不同。Epichlo?相关生物碱的保护作用是其中最一致证明的例子之一；然而，许多非麦角菌科内生真菌的研究仍然基于代谢物产生与病原体抑制之间的相关性，而没有直接的功能验证。此外，内生真菌的引入可能产生生态和生理上的权衡，包括改变的宿主生长分配、与有毒生物碱积累相关的家畜毒性，或取决于宿主基因型和环境条件的田间表现不一致。因此，成功的应用需要评估生态相容性、家畜安全性和长期田间稳定性，而不是仅仅依赖实验室条件下的功效。
4.2. 内生真菌介导的对个体和复合非生物胁迫的响应
非生物胁迫在草地生态系统中经常单独或同时发生；干旱、盐分和高温是影响牧场生产力的主要胁迫。虽然复合胁迫不能简单地视为两个独立胁迫的总和，但同时暴露和顺序暴露可能具有不同的生理、代谢和信号效应。因此，从干旱、盐分或高温中观察到的反应不能直接应用于干旱-盐分或干旱-高温条件。本节简要概述了与内生真菌相关的主要非生物胁迫响应，审视了干旱与盐分胁迫以及干旱与高温胁迫相互作用的新证据，并总结了阻碍解释干旱-盐分和干旱-高温响应的实验和田间验证空白。
4.2.1. 个体非生物胁迫下的核心机制
非生物胁迫，包括诸如干旱-盐分或高温-干旱相互作用以及重金属压力等复合挑战，通过抑制水分和养分吸收、膜损伤、光合作用紊乱以及氧化应激的发生来降低植物生长。在作物中，真菌内生真菌通过多种协调机制，经由集体的生理和分子适应，并结合近期多组学研究的在复合胁迫下激活的途径，来促进非生物胁迫耐受性。一个主要的功能结果是胁迫下抗氧化保护的增强。内生真菌定殖植物的抗氧化能力通常倾向于减少氧化损伤并进一步增强胁迫下的生长。这种抗氧化能力的增强也与光合活性和生物量保持的增加有关，这两者都是内生真菌胁迫缓解研究中确定的典型结果测量指标。第二个功能结果是胁迫下激素调节的改善。基于激素串扰，内生真菌可能修改脱落酸、乙烯和茉莉酸相关反应，从而支持相对含水量维持、叶绿素保持、根系性能以及生长与胁迫防御之间的平衡。第三，内生真菌可能促进渗透和离子稳态，这对于干旱和盐分条件至关重要。大多数内生真菌相关的耐受机制涉及相容性溶质如脯氨酸和可溶性糖的更大积累，以及Na+/K+平衡的改善。例如，种子携带的Epichlo? gansuensis与盐分条件下离子稳态和胁迫生理学的变化有关，这被用来支持一个模型，即内生真菌通过贡献一种综合的代谢适应性反应和胁迫响应基因调控参与耐受性。根部定殖的DSE可能通过改善根部水分关系、养分获取、渗透调节物质积累和在干旱及盐分胁迫下的抗氧化保护来补充这些反应；然而，这些效应的幅度和方向因真菌菌株、宿主物种和土壤环境而异。这些适应性保护酶和膜，稳定蛋白质，并帮助维持气孔功能和细胞膨压。值得注意的是，在田间条件下，非生物耐受性通常是多因素的，内生真菌特别有用，因为它们可以调节多种生理机制。Actinomucor elegans和Podospora bulbillosa在单个作物系统内为番茄提供了在多种非生物限制下的可量化保护。这项研究有助于弥合概念模型与潜在接种策略之间的差距。最后，非生物和生物胁迫响应之间的相互作用凸显了采用综合泛组学方法培育多胁迫恢复力的必要性。内生真菌通过稳定植物生理学和启动胁迫防御网络来减轻胁迫-疾病协同作用，从而减少干旱或盐分条件下病原体的脆弱性。这种联合优势——胁迫缓冲和降低疾病风险——是真菌内生真菌越来越多地被推广为气候恢复力增强剂的原因之一，泛组学和预测工具正指导着它们在可持续农业中的选择。
4.2.2. 内生真菌介导的对干旱-盐分相互作用的响应
干旱和盐分胁迫不应被视为两个单独胁迫的简单总和。干旱和盐分在自然和农业环境中频繁发生，它们的相互作用不应被视为两个独立胁迫的简单加性效应。盐分导致离子毒性和营养失衡，而过量的Na+积累是干旱胁迫造成的植物水分亏缺的原因，并且盐分胁迫还通过过量的离子积累和受损的离子稳态导致K+/Na+比例的破坏。因此，它们的共同发生可能会加剧根部吸水、气孔导度、光合作用、膜完整性和生物量积累方面的限制。这些效应的严重程度取决于胁迫是同时发生还是顺序发生，因为先前暴露于一种胁迫可能使植物对第二种胁迫要么启动，要么进一步敏感。最近的实验研究表明，复合干旱-盐分胁迫诱导了无法从单个胁迫处理中预测的特异性生理和分子反应。在棉花中，同时的干旱和盐分暴露引起了生长、生理表现和胁迫适应的基因型依赖性变化。同样，小麦的转录组分析显示，复合干旱-盐分胁迫激活了与胁迫耐受性相关的独特调控通路。内生真菌可能通过植物生长、抗氧化防御、渗透调节和离子稳态的协调调控，为复合胁迫适应做出贡献。然而，在单个干旱或盐分处理下鉴定的机制，在没有实验验证的情况下，不应直接被视作复合胁迫耐受性的证据。最近已从实验研究中获得了支持内生真菌介导的干旱-盐分耐受性的直接证据。内生真菌通过增强生物量产生、根系发育、叶绿素维持和抗氧化活性，改善了干旱和盐分条件下大麦的表现。类似地，存在于沙漠适应地区的真菌内生真菌，通过增强生理调节和减少氧化损伤，提高了作物植物的干旱和盐分耐受性。由于检验禾草-内生真菌关联中复合非生物胁迫的实验研究仍然少于其他作物中可用的研究，此处考虑来自非禾草系统的证据是为了提供机制支持，而非对禾草-内生真菌相互作用的直接验证。未来的研究应通过设计结合生理学、转录组学、代谢组学和微生物学分析的因子对照实验，来确定在单个胁迫下观察到的保护效应在两种胁迫同时施加时是被保留、减弱还是增强，以及这些反应是否在不同宿主基因型、内生真菌菌株、胁迫强度和发育阶段间保持一致。
4.2.3. 内生真菌介导的对干旱-高温相互作用的响应
干旱-高温相互作用施加了一种独特的生理胁迫，温度的升高增加了蒸散需求，而干旱降低了蒸发冷却能力，从而加剧了植物水分亏缺和热胁迫。这两个胁迫因素共同会加剧叶片脱水，使膜不稳定，使蛋白质变性，损害光合反应中心，并减少碳同化。干旱响应可能因高温水平而改变，因此暴露的顺序和持续时间是影响植物干旱响应的关键因素。来自禾草-内生真菌系统的实验证据表明，真菌共生可以改善植物在复合干旱和高温胁迫下的表现。在匍匐紫羊茅中，感染真菌内生真菌Epichlo? festucae改变了宿主在同时干旱和高温胁迫下的生理反应，表明内生真菌关联有助于多年生禾草的胁迫适应。在谷类系统中也已证明了相关的保护性反应，即真菌内生真菌关联改善了小麦在复合高温和干旱胁迫下的种子萌发和早期发育。与内生真菌相关的小麦植株在高温和干旱条件下表现出改善的籽粒产量和种子活力。总的来说，这些研究表明，内生真菌介导的保护可能涉及在复合胁迫暴露期间维持水分关系、光合活性、抗氧化调节和保护生殖性能。然而，现有证据仅限于少数禾草和谷类系统，并且负责内生真菌介导的干旱-高温耐受性的机制尚未完全阐明。在单个干旱或高温胁迫下报告的反应不应直接外推至复合胁迫条件，因为温度和水可用性之间的相互作用可以产生独特的生理结果。因此，直接证据应基于包含对照、仅干旱、仅高温和干旱加高温处理的实验，并同时比较内生真菌定殖和无内生真菌植物。此类比较对于确定内生真菌效应在复合胁迫下是加性、协同、中性还是拮抗性是必要的。这种区分对于牧场禾草尤其重要，因为在田间条件下，高温和水分限制的暴露随季节、发育阶段和冠层条件而变化。
4.2.4. 当前证据空白与复合胁迫研究的优先事项
关于内生真菌介导的复合胁迫耐受性的研究仍然有限，原因在于术语不一致和实验验证不足。尽管最近的研究已经证明了内生真菌在个体和复合非生物胁迫下的有益效果，但当前的证据基础仍受限于宿主物种、真菌菌株、胁迫组合和实验条件的变化。植物常常在分别暴露于多种胁迫后被标记为多胁迫耐受型，但这并不能证明其具备承受同时或顺序胁迫的能力，因为复合胁迫可能产生无法从单胁迫实验中预测的独特生理和分子反应。因此，复合胁迫研究报告应注明每个胁迫处理的顺序、强度、持续时间和重叠情况，以及直接证据与从涉及单一胁迫的实验中推断出的机制。未来的实验应使用因子设计，包括未胁迫对照、每种单独胁迫以及每种复合胁迫，以确定内生真菌效应是加性、协同还是胁迫特异性的，而不是假设普遍保护。为了比较内生真菌定殖植物与无内生真菌植物，应包含足够的生物学重复，并标准化条件。这种方法对于禾草-内生真菌系统尤为重要，因为胁迫耐受性可能依赖于宿主基因型、真菌特性和环境条件。测量应包括生理参数、离子和代谢物谱、光合参数、根系特性、生物量产生、繁殖参数以及宿主-真菌复合体的分子响应。转录组学、代谢组学和表型方法的整合将是识别复合胁迫适应背后稳定调控机制的必要条件，而非瞬时胁迫响应。这些研究应确定在长期复合胁迫下是否发生稳定的内生真菌定殖和传播。另一个问题是，现有数据大多来自生长箱、水培系统或盆栽实验。需要进行更多的重复田间试验，以确定在受控环境下观察到的益处能否在不同的地点、季节和管理条件下重现，从而确立在未来的气候情景下内生真菌介导的胁迫耐受性的一致性和生态相关性。这个问题变得尤为重要，因为尽管越来越多的证据表明植物在自然生态系统中经历复杂的环境胁迫组合，但在现实田间条件下的多因素胁迫研究仍然稀缺。作为一个新兴的研究领域，在获得足够证据之前，不应将内生真菌介导的复合胁迫耐受性呈现为保证的农艺成果。尽管越来越多的证据表明内生真菌可以增强干旱、盐分和高温耐受性，但证据强度在不同宿主-内生真菌组合、胁迫类型和实验条件之间存在差异。许多提出的机制，包括抗氧化激活、渗透调节和离子调节，主要受控环境研究的支持，而它们在复杂田间条件下的贡献仍然不清楚。因此，未来的研究应优先进行多环境验证，以区分稳定的胁迫耐受机制与情境依赖的反应。
5. 内生真菌介导的生长促进和生理优化的协调机制
内生真菌是新兴的天然生物增强剂，可改善植物生长和生产力。它们的促生长机制包括激素调节、养分动员和改善植物生理。这些综合效应有助于提高植物的生物量产生和改善生殖表现。近期的研究表明，内生真菌可以通过复杂的生化和分子信号通路影响从种子萌发、根长到开花和种子发育的多个发育阶段。这些效应与内源性植物生长调控网络整合在一起。在促生长的背景下，真菌来源的生长素、赤霉素和细胞分裂素可能支持细胞伸长、根起始、侧根形成、枝条发育、生殖表现和延缓叶片衰老。发育良好的根系系统可改善锚定并增加水分和养分的吸收能力。此外，产生ACC脱氨酶的内生真菌可以减少过量乙烯积累，从而维持营养生长。除了激素调节，内生真菌还能显著增强植物养分获取能力，这是决定促生长的一个主要因素。一些内生真菌同化无机氮，向宿主转移含氮化合物，并影响参与氮循环过程的根际微生物群落。磷溶解是另一个重要过程，磷酸酶和有机酸将不溶性磷酸盐化合物转化为植物可利用的形式。这个过程在有效磷缺乏、可能限制植物生长的土壤中尤其
