源自莫哈韦芽孢杆菌KRS009的4-甲基戊酸：一种防治采后灰霉病的有前景生物防治剂

《Postharvest Biology and Technology》：4-Methylvaleric acid derived from Bacillus mojavensis KRS009 as a promising biocontrol agent against postharvest gray mold

　　

•来自Bacillus mojavensis KRS009的挥发性有机化合物（VOCs）可抑制灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）的生长和发育；•KRS009释放的VOCs通过干扰植物免疫抑制灰霉病；•KRS009的VOCs对采后水果具有显著的保鲜和品质维持效果；•4-甲基戊酸是KRS009控制植物灰霉病的关键VOCs。1. 引言植物致病真菌对农业和园艺作物的产量和品质构成严重威胁，是粮食安全与公共健康的持续性挑战（Yang et al., 2025, Fisher et al., 2020, Almeida et al., 2018, Doehlemann et al., 2017）。其中，由灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）引起的灰霉病是一种典型病害，可感染花卉、果实、叶片和茎干等多种寄主植物。该病原体在土壤和植物残体中长期存活，极大增加了其防治难度（Bi et al., 2023）。灰霉病造成严重的采后年度损失，超过200种植物的损失率超过50%，如葡萄、番茄和草莓。目前，化学杀菌剂仍是防治灰霉病最经济、最广泛使用的方法。然而，其长期大量施用已导致病原体抗药性日益严重，同时也引发环境污染和食品安全风险的担忧（Sofianos et al., 2023, Wei et al., 2022, Yin et al., 2023, Martins et al., 2019, Amiri et al., 2018）。因此，开发高效、环保、低毒的替代防治策略已成为迫切的研究优先事项（Chen et al., 2023, Zhang et al., 2020, Lu et al., 2010）。此前研究开发了一种由铜铁纳米晶体（CuFe NCs）组成的抗真菌纳米酶。这些CuFe纳米晶体可维持其酶活性超过一年，实现持久抗真菌效果。此外，还开发了一种多功能薄膜（CuFe NCs/海藻酸钠/明胶，命名为Cu-Fe/SL），兼具保水和抗真菌特性。该薄膜可保护易腐食品超过19天，并保持水分超过一周（Liu et al., 2025）。相比之下，生物防治技术因其低成本、可持续性和生态安全性而受到广泛关注。这些方法主要利用有益微生物或其代谢产物来抑制植物致病真菌（Poveda et al., 2020）。例如，Bacillus velezensis NEAU-HLD-9及其粗提脂肽对菜豆灰霉病表现出显著防效（Zhang et al., 2026）。近年来，微生物挥发性有机化合物（VOCs）在采后病害管理中的潜力日益凸显。研究表明，微生物VOCs不仅能抑制多种植物病原菌的孢子萌发和菌丝生长，还能促进植物生长并诱导系统性抗性（Toral et al., 2021）。与传统液体杀菌剂相比，VOCs具有非接触作用模式，不依赖于生物防治微生物与病原体的直接接触，可实现远距离杀菌（Elsherbiny et al., 2025）。此外，气态抗真菌系统避免了活微生物在农产品上的残留，从而缓解了生物安全问题，展现出广阔的应用前景（Guo et al., 2023）。芽孢杆菌属（Bacillus sp.）被认为是产生生物活性VOCs的主要微生物类群之一（Grahovac et al., 2023, Toffano et al., 2017）。大量研究证实了芽孢杆菌来源的VOCs对灰霉病的抑制作用。例如，Bacillus siamensis释放的VOCs显著抑制了灰葡萄孢菌的菌落生长和孢子萌发，降低了樱桃番茄果实的发病率，并延缓了果实软化和维生素C降解（Yun et al., 2025）。类似地，内生细菌Bacillus sp. NEAU-ZGX24产生的VOCs抑制了灰葡萄孢菌的菌丝发育、孢子萌发和孢子形成，同时降低了番茄对真菌感染的易感性（Zuo et al., 2025）。B. velezensis P2–1产生的VOCs诱导了灰葡萄孢菌的菌丝畸形和细胞膜损伤，并激活了苹果果实中病程相关（PR）基因的表达（Yuan et al., 2025）。此外，野生葡萄内生菌株Bacillus subtilis K1产生的VOCs可显著抑制灰葡萄孢菌的菌丝生长，还能诱导葡萄中更高水平的防御相关酶（Li et al., 2022）。然而，目前关于Bacillus mojavensis来源VOCs抗真菌功能的研究仍然有限。鉴于上述研究背景，本研究聚焦于从中国新疆健康棉花植株根际土壤中分离出的一株拮抗菌株KRS009，此前已被鉴定为B. mojavensis（Zhao et al., 2024a）。本研究旨在系统评估其挥发性有机化合物对灰葡萄孢菌的抗真菌活性，从而为开发VOCs作为生物防治剂提供理论依据。具体目标包括：（1）通过体外联合扫描电子显微镜（SEM）评估VOCs对灰葡萄孢菌菌落和菌丝形态的抑制效应；（2）利用果实活体模型评价VOCs对灰霉病的防效；（3）探究VOCs处理对葡萄果实品质及抗性相关指标的影响；（4）通过顶空固相微萃取联用气相色谱-质谱（HS-SPME-GC/MS）鉴定VOCs成分，并通过测定其中效浓度（EC??）值筛选关键活性物质；（5）初步探索活性化合物是否通过调控合成或代谢途径影响植物系统性抗性。2. 材料与方法2.1 微生物与植物材料的培养B. mojavensis KRS009菌株在Luria-Bertani（LB）液体培养基（胰蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L、酵母提取物5 g/L、双蒸馏水ddH?O 1000 mL）中，于28℃下培养。该菌株分离自中国新疆受病原体侵染的棉田中健康植株的根际土壤。灰葡萄孢菌在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基（马铃薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、琼脂15 g/L、ddH?O 1000 mL）中，于25℃下培养。在进行防效测定之前，烟草幼苗（Nicotiana benthamiana LAB）在温室中培养四周，温度为25℃，光暗周期为16小时光照和8小时黑暗。每株烟草幼苗生长至适宜株龄后，先种植于直径10 cm、高8 cm的花盆中，使用营养土和蛭石按1:1（v/v）比例混合的育苗基质。浇水频率为每两天一次，浇水量取决于育苗基质的吸收量。虽然同一温室的不同区域可能生产其他批次的烟草幼苗，但这些烟草植株在整个生长季期间固定在温室中的固定位置进行培养。所有实验均使用该批次相同规格的烟草幼苗。2.2 体外抗真菌活性测定采用双平板密封法评估KRS009释放的挥发性有机化合物（VOCs）对灰葡萄孢菌的抗真菌活性。具体而言，将50 μL KRS009细胞悬液（OD??? = 1.0）涂布于LB平板上，同时在PDA平板中心接种直径2 mm的病原真菌菌丝块。将两个处理平板用Parafilm密封后，于25℃下培养4天。对照设置为两个密封平板：一个LB平板涂布50 μL LB液体培养基，一个PDA平板接种病原真菌。每组重复5个平板，该测定重复进行3次。测量每个平板上真菌菌落的直径，抑制率（IR）计算公式如下：IR (%) = [(a-b)/(a-2)] × 100（其中"a"为空白对照的菌落直径，"b"为处理的菌落直径。菌丝块直径为2 mm）。无细胞培养滤液（CFCF）按照先前描述的方法制备，并进行少量修改。将KRS009发酵液以8000 rpm离心20分钟，收集上清液并通过0.22 μm微孔滤膜过滤。将无细胞上清液分别以5%、10%和20%（v/v）的最终浓度加入PDA培养基中（补充卡那霉素至50 mg/mL）。将灰葡萄孢菌的菌丝块接种于这些平板上，在25℃下培养4天后观察菌丝的生长发育情况。2.3 显微观察在VOCs处理和KRS009 5%发酵上清液处理4天后，使用体视显微镜（Nikon SMZ18）观察灰葡萄孢菌的菌丝。将KRS009发酵液与灰葡萄孢菌菌丝共同培养2天后，使用微分干涉对比显微镜（DIC）进行观察。双对峙培养试验用于观察灰葡萄孢菌的菌丝。收集这些菌丝，在2.5%戊二醛和4%多聚甲醛混合固定液中固定。扫描电子显微镜（SEM）观察前，将预处理样品分别用30%、50%、70%、80%、90%、95%和100%的梯度乙醇脱水，然后进行丙酮浸渍处理。样品使用CO?临界点干燥器干燥。2.4 RT-qPCR为检测菌丝生长发育相关基因的表达，将5 μL KRS009发酵液和2 × 2 mm的灰葡萄孢菌菌丝块分别接种在PDA上的有机滤膜上，间隔15 mm。培养后收集真菌菌丝进行总RNA提取（EASYspin Plus RNA速提试剂盒，Aidlab）和cDNA合成（cDNA合成supermix试剂盒，TransGen），均包含gDNA去除步骤。与菌丝发育、黑色素合成、囊泡转运和自噬相关的标记基因通过RT-qPCR分析，并以灰葡萄孢菌肌动蛋白基因作为内参进行标准化。为检测烟草免疫相关基因的表达，从用KRS009无细胞上清液或VOCs处理24小时的烟草叶片中分离总RNA，并按上述方法合成cDNA。通过RT-qPCR评估超敏反应（HR）、水杨酸（SA）和茉莉酸（JA）途径相关标记基因的表达，以N. benthamiana肌动蛋白基因作为内参进行标准化。为检测4-甲基戊酸引发的免疫信号通路相关基因表达，将31.5 μL标准品（EC??为2.91 μg/mL，密度为0.923 g/mL）滴于培养皿中的滤纸上，然后将培养皿放入密封的10 L容器中。RT-qPCR使用TransStart Top Green qPCR SuperMix（+DyeII）（TransGen）在以下条件下进行：95℃ 3分钟，随后40个循环（变性95℃ 15秒，退火60℃ 20秒，延伸72℃ 20秒）。相对转录水平使用2?ΔΔCT方法计算（Livak & Schmittgen, 2001）。每个处理包含三个技术重复，上述测定分别重复进行3次。涉及的引物对列于表S1。2.5 KRS009对烟草及采后水果灰霉病的生物防治效果评价在四周龄烟草幼苗上评估KRS009无细胞上清液和VOCs对烟草灰霉病的生物防治效果。对于上清液处理，将叶片喷洒上清液或LB培养基（对照），然后将植株置于密封容器中于25℃下保存12小时。随后用2 × 2 mm的灰葡萄孢菌菌丝块接种叶片，在相同条件下培养3天后测量病斑直径。每个处理使用至少5株幼苗的15片叶片。对于VOCs处理，将100 μL KRS009发酵液（OD??? = 1.0）涂布于LB琼脂上，在28℃下培养24小时，然后将培养平板与预接种灰葡萄孢菌的烟草叶片密封在一起3天后测量病斑。在葡萄（巨峰葡萄，Vitis labruscana 'Kyoho'）、樱桃番茄（Solanum lycopersicum var. cerasiforme）和草莓（Fragaria × ananassa 'Red Face'）上评估KRS009产生的VOCs对采后灰霉病的防治效果。为检测KRS009 VOCs对葡萄和樱桃番茄灰霉病的抑制作用，将健康的巨峰葡萄和樱桃番茄进行表面消毒（0.2% NaOCl，10分钟），冲洗、风干、造成伤口后，接种1 × 1 mm2的灰葡萄孢菌菌丝块。果实进行四种处理：（1）仅密封容器；（2）在密封容器中暴露于KRS009的VOCs；（3）在密封容器中暴露于KRS027的VOCs（阳性对照）；（4）暴露于大肠杆菌DH5α的VOCs（阴性对照）。对于VOCs暴露处理，将100 μL细菌培养液（OD??? = 1.0）涂布于LB琼脂上，在28℃下培养24小时以促进细菌生长，然后将三个未加盖的培养皿与接种果实密封在一起。在第0、3和5天对果实进行拍照，并在第5天测量病斑直径。

皮肤（外果皮）样品被采集；提取了总基因组DNA，并通过以B. cinerea肌动蛋白基因进行qPCR来量化B. cinerea的相对生物量，以V. labruscana肌动蛋白基因作为内源性对照。为评估KRS009挥发性有机化合物（VOCs）对由不同B. cinerea菌株引起的草莓灰霉病的防治效果，草莓（'红脸'）果实经过相同的消毒、伤口处理和接种，分别接种B. cinerea菌株B05.10或GM012。比较了四个处理组：每种菌株单独处理或与KRS009 VOCs联合处理。按照上述方法制备KRS009平板并与接种果实共培养。果实暴露于VOCs的第一天定义为"第0天"。在第0、3、5天拍摄病斑发育照片，并在第5天记录病斑直径。

2.6. N. benthamiana免疫反应检测

将菌株KRS009接种至50 mL LB液体培养基中，在28℃、200 rpm摇床培养箱中培养三天。按照上述方法制备无细胞上清液，并用LB液体培养基稀释为六个浓度梯度（5%、10%、15%、20%、25%和30%）。将各浓度的无细胞上清液注射至四周龄烟草LAB植株的叶片中。注射后3小时记录烟草叶片坏死情况。使用3,3′-二氨基苯胺（DAB）染色观察活性氧物种（ROS）爆发。具体而言，将注射了不同浓度上清液的烟草叶片浸入DAB染色液（0.05% wt/vol DAB，Sigma）中。用铝箔包裹容器，在30 rpm、28℃摇床上过夜培养。随后将叶片转移并浸入无水乙醇中，再在水浴中加热褪色。对染色叶片拍照以观察H?O?积累情况。

2.7. KRS009挥发性有机化合物对葡萄果实品质和防御酶活性的影响

为研究菌株KRS009产生的挥发性有机化合物（VOCs）对葡萄浆果特性的影响，将涂布有50 μL KRS009发酵液（OD??? = 1.0）的平板在28℃培养24小时，与新鲜采收的葡萄一起放置在保鲜盒中。涂布等量LB培养基的平板作为对照。在治疗后第0、7、14和21天从保鲜盒中取出葡萄，根据Cao等（2020）报道的方法测定葡萄品质指标及其变化趋势，其中第0天定义为葡萄暴露于KRS009 VOCs的当天。葡萄品质指标包括可溶性糖含量（SSC）、可溶性蛋白含量、可滴定酸含量（TAC）、总酚含量、黄酮类含量和花青素含量。在第0、3、7天使用试剂盒（Solarbio，北京，中国）测定葡萄中过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、多酚氧化酶（PPO）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、过氧化氢酶（CAT）的活性以及丙二醛（MDA）含量。将新鲜葡萄果皮样品在液氮中研磨，迅速称取1 g粉末于50 mL离心管中。加入去离子水定容至20 mL。混合物在4℃、12,000 r/min离心15分钟，使用pH计测量上清液的pH值（Zhao等，2016）。用空白LB平板处理的葡萄作为对照。每组由五个平板组成，该实验重复三次。

2.8. VOCs成分鉴定

将1-十五碳烯标准品（Tci Chemicals，上海，中国）稀释至5 mg/L浓度作为内标溶液。将LB培养基分装至无菌棕色顶空样品瓶（Supelco，美国）中，倾斜形成斜面。随后，将100 μL KRS009细菌发酵液（OD??? = 1.0）加入LB培养基斜面表面。用Parafilm密封样品瓶，在28℃下培养3天。通过固相微萃取-气相色谱-质谱联用（HS-SPME-GC/MS）（Shimadzu，日本）分析KRS009产生的VOCs，以空白LB培养基作为对照。每个实验组包含五个生物学重复。

分离使用DB-WAX弹性石英毛细柱进行，以氦气（纯度99.999%）为载气，流速为1.0 mL/min。使用Shimadzu软件进行数据分析。通过将质谱图与NIST数据库进行比对来鉴定VOCs。使用对内标（1-十五碳烯）的峰面积归一化来进行处理间VOC轮廓的相对半定量比较，以比较样品间的相对丰度。此外，将空白LB培养基样品中检测到的挥发性物质从KRS009样品结果中减去。使用C?-C??正烷烃系列确定已鉴定化合物的保留指数（RI），并与NIST Chemistry WebBook（https://webbook.nist.gov/chemistry）中的参考值进行比较。

2.9. 选定化合物半最大效应浓度（EC??）的测定

使用分室培养皿法评估抗真菌活性。将适量PDA培养基倒入培养皿的一个隔室中，在对面隔室放置无菌2 × 2 cm滤纸条。将2 × 2 mm B. cinerea菌丝块接种至PDA培养基上。选择十种具有潜在抑制活性的标准化学品，以梯度体积（0.9、9、18 μL等）施加于滤纸上。在25℃培养四天后，通过测量菌落半径来评估真菌生长情况。对照组用等体积无菌水代替化学溶液。每个浓度包含五个生物学重复，整个实验独立重复两次。施加化学品的质量浓度根据培养皿顶空体积计算。使用IBM SPSS Statistics 25（IBM Corp.，Armonk，NY，USA）进行剂量-反应建模。通过非线性回归分析拟合四参数逻辑模型来确定半最大效应浓度（EC??）。由于各化合物摩尔量差异较大，我们通过使用等体积来标准化所有受测化合物的实验设置，随后以质量浓度（μg/mL）计算名义浓度用于EC??测定。

2.10. 统计分析

所有实验均至少设置三个独立生物学重复。数据以均值±标准差（±SD）表示。两组间比较采用非配对Student's t检验。各时间点多组比较采用单因素方差分析后进行Duncan多重范围检验。统计显著性设定为P < 0.05。所有分析使用SPSS 17.0（IBM，Chicago，USA）进行。

3. 结果

3.1. B. mojavensis KRS009的VOCs抑制B. cinerea的生长发育

采用双封平板培养法评估VOCs对烟草灰霉病病原菌B. cinerea的影响。结果表明，KRS009产生的VOCs显著抑制了B. cinerea在PDA培养基上的菌落生长和扩展（图1A）。在该实验中，VOCs处理对真菌菌落生长的抑制率达到86.86%（图1B）。体视显微镜检查菌丝形态显示，暴露于VOCs的B. cinerea表现出肿胀和畸形的菌丝，特征为生长紊乱和异常树枝状分枝。相比之下，对照组菌丝保持完整，呈正常径向生长（图1A）。经过三天双面对抗培养后，对抑制区边缘的形态缺陷进行扫描电子显微镜（SEM）分析，确认KRS009产生的VOCs处理导致真菌细胞显著损伤和变形（图1A）。

图1. B. mojavensis KRS009对B. cinerea的抑菌活性检测。（A）菌株KRS009产生的VOCs对B. cinerea的抑制效果；菌株KRS009产生的VOCs在体视显微镜下对B. cinerea菌丝形态的影响；菌株KRS009产生的VOCs在SEM下对B. cinerea菌丝形态的影响。（B）菌株KRS009产生的VOCs处理对B. cinerea菌落直径的影响。（C）使用RT-qPCR检测B. cinerea生长相关基因的表达水平，包括囊泡运输相关基因（BcExo70、BcSec3）、菌丝生长基因（BcHBF1、BcCyp2）、黑色素合成基因（Bcscd1、BcPKS9）、自噬过程基因（BcAtg3、BcAtg6、BcAtg7、BcAtg8）、致病性基因（BcKMO、Bcser2）、cAMP信号通路基因（Bcgb1）以及替代氧化酶基因（BcAOX）。误差线代表标准差。*、** 和 **** 分别代表根据非配对Student's t检验，P < 0.05、P < 0.01 和 P < 0.0001 的显著差异。

通过RT-qPCR分析生长和发育相关基因的相对转录水平，比较B. cinerea对照组与KRS009 VOCs处理组。结果显示，囊泡运输相关基因（BcExo70、BcSec3）、菌丝发育相关基因（BcHBF1、BcCyp2）和黑色素生物合成基因（BcScd1、BcPKS9）的表达显著下调。子实体形成、分生孢子和菌丝生长速率相关基因（BcKMO、Bcser2）也下调。此外，G蛋白β亚基基因Bcgb1和线粒体氧化磷酸化相关基因BcAOX在KRS009 VOCs响应下显著下调。此外，自噬过程——一种真核细胞中降解衰老蛋白和细胞器以维持细胞稳态的调控机制——受到KRS009施加的生物胁迫的影响，表现为自噬相关基因BcAtg3、BcAtg6、BcAtg7和BcAtg8表达下调（图1C）。

总之，这些发现表明菌株KRS009主要通过产生VOCs发挥直接抗真菌活性，VOCs损害菌丝发育、子实体形成、分生孢子产生和黑色素合成，从而共同贡献于整体抗真菌效果。

3.2. 菌株KRS009有效抑制烟草灰霉病

为进一步研究菌株KRS009对Botrytis cinerea的抑制作用，在病原菌接种前12小时将其发酵液喷洒于四周龄烟草叶片上，随后培养3天。同时，在病原菌接种时以KRS009产生的VOCs处理烟草叶片，然后培养3天。结果显示，与LB发酵液处理的对照组相比，KRS009显著降低了灰霉病严重程度，部分叶片未表现出病害症状（图2A、E）。相应地，KRS009处理叶片的病斑直径显著小于对照组（图2B、F）。此外，将KRS009无细胞上清液注射至烟草叶片中可诱导活性氧物种（ROS）的剂量依赖性积累，表现为随上清液浓度增加3,3′-二氨基苯胺（DAB）染色逐渐加深（图2C）。

图2. 菌株KRS009产生的无细胞上清液和挥发性有机化合物（VOCs）可有效控制烟草灰霉病。（A）菌株KRS009无细胞上清液抑制烟草灰霉病病斑扩展的体内表型。（B）KRS009菌株无细胞上清液处理烟草灰霉病后病斑直径的统计分析。（C）不同浓度的KRS009菌株无细胞上清液可诱导烟草免疫反应。（D）KRS009菌株无细胞上清液可调控烟草免疫相关基因的表达。（E）KRS009菌株VOCs抑制烟草灰霉病病斑扩展的体内表型。（F）KRS009菌株VOCs处理烟草灰霉病后病斑直径的统计分析。（G）KRS009菌株产生的VOCs调控烟草免疫相关基因的表达。误差线代表标准差。*、**、*** 和 **** 分别代表根据非配对Student's t检验，P < 0.05、P < 0.01、P < 0.001 和 P < 0.0001 的显著差异。

此前研究表明，生防微生物可通过分泌次级代谢产物和挥发性有机化合物（VOCs）激活植物免疫并诱导系统获得性抗性（ISR），从而增强植物对病原真菌等生物胁迫的抵抗力（Liang等，2025）。为研究KRS009是否触发植物防御反应，我们使用逆转录定量PCR（RT-qPCR）分析了与超敏反应（HR）、水杨酸（SA）和茉莉酸（JA）信号通路相关的标记基因的表达水平。结果显示，与LB发酵液处理的对照组相比，喷洒KRS009无细胞上清液后2天，烟草叶片中HR通路标记基因（NbHIN1和NbGlnb）和SA通路标记基因（NbPR1、NbPR2和NbPR5）的表达显著上调（图2D）。同样，与对照组相比，KRS009产生的VOCs处理24小时后，烟草叶片中HR通路标记基因（NbGlnb）和SA通路标记基因（NbPR1、NbPR2和NbPR5）的表达显著上调（图2G）。

3.3. KRS009的VOCs显著抑制采后灰霉病的发生

本研究证实，菌株KRS009产生的挥发性有机化合物（VOCs）显著抑制真菌生长，特别是在体外对B. cinerea的抑制作用（图1A）。

# 进一步调查KRS009来源的VOCs对葡萄、樱桃番茄和草莓果实灰霉病发展的抑制作用

对KRS009来源的挥发性有机化合物（VOCs）抑制葡萄、樱桃番茄和草莓果实灰霉病发展的进一步研究表明，KRS009产生的VOCs在与接种了*Botrytis cinerea*（灰葡萄孢）的果实共培养（密封容器内，第3天和第5天）时表现出优异的生防效果。与对照组相比，VOC处理果实的病害症状减轻（图3A、E），病斑直径显著减小（图3B、F），真菌生物量减少（图3D、H），抑制率达到100%（图3C、G）。此外，本研究评估了KRS009产生的VOCs对草莓上由两种*Botrytis cinerea*菌株引起的灰霉病的生防效果。结果表明，3天或5天培养产生的VOCs均表现出显著的生防效果。与对照组相比，VOC处理的草莓果实病害症状减轻（图3I），病斑直径显著减小（图3J），抑制率达到100%（图3K）。

图3. KRS009释放的VOCs减少采后灰霉病的发生。（A）接种*Botrytis cinerea*后0、3和5天葡萄上灰霉病的发生情况。（B）接种后5天葡萄上灰霉病的病斑直径。（C）接种*Botrytis cinerea*后5天葡萄的腐烂率。（D）接种后5天葡萄上*Botrytis cinerea*的相对生物量。（E）接种*Botrytis cinerea*后0、3和5天番茄上灰霉病的发生情况。（F）接种后5天番茄上灰霉病的病斑直径。（G）接种*Botrytis cinerea*后5天番茄的腐烂率。（H）接种后5天番茄上*Botrytis cinerea*的相对生物量。（I）接种两种*Botrytis cinerea*菌株后0、3和5天草莓上灰霉病的发生情况。（J）接种两种*Botrytis cinerea*菌株后5天草莓上灰霉病的病斑直径。（K）接种两种*Botrytis cinerea*菌株后5天草莓的腐烂率。误差线代表标准差。***和****分别代表根据非配对Student's t检验P < 0.001和P < 0.0001的显著差异。

## 3.4 KRS009的VOCs对果实品质和防御反应的影响

本研究通过设置对照组和VOC处理组，进一步探讨了KRS009来源的VOCs对葡萄果实采后保鲜的影响。在采后0、3和7天测定了防御酶活性——过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、多酚氧化酶（PPO）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、过氧化氢酶（CAT）和丙二醛（MDA）。此外，在采后0、7、14和21天测定了包括可溶性糖含量（SSC）、可溶性蛋白、糖酸比、总酚类、类黄酮和花青素等品质参数。结果表明，POD、SOD和CAT活性在0–3天内升高，随后在3–7天内下降，VOC处理果实的这些变化幅度显著大于对照组（图4A-C）。相反，PAL和PPO活性在0–7天内持续下降，对照组下降更为显著（图4D、E）。0–7天内MDA的逐渐积累表明采后胁迫下细胞受到损伤（图4F）。在延长贮藏期（0–21天），VOC处理果实的可溶性固形物含量（SSC）持续较低，可溶性蛋白含量下降幅度较小，糖酸比显著低于对照组。相比之下，总酚类、类黄酮和花青素含量明显更高（图4G-K）。综上所述，这些结果表明KRS009-VOCs通过在关键早期贮藏阶段短暂上调防御酶活性来增强保鲜效果，同时延迟与成熟相关的腐烂并减缓采后果实的营养品质退化。

图4. KRS009的VOCs对葡萄品质和酶活性的影响。（A）POD活性。（B）SOD活性。（C）CAT活性。（D）PAL活性。（E）PPO活性。（F）MDA含量。（G）可溶性糖含量。（H）滴定酸度含量。（I）可溶性蛋白含量。（J）总酚类含量。（K）类黄酮含量。（L）花青素含量。误差线代表标准差。*、**、***和****分别代表根据非配对Student's t检验P < 0.05、P < 0.01、P < 0.001和P < 0.0001的显著差异。

## 3.5 KRS009的VOCs鉴定及单组分化合物对*Botrytis cinerea*的生物活性

使用顶空瓶收集KRS009菌株产生的VOCs，并通过气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析其组成（图5A）。分析结果显示存在以下挥发性产物，包括1-丁醇、2-庚酮、异戊醇、戊烷、2-辛酮、dl-次黄酸内酯、2,3-丁二醇、2-壬酮、丙酮酸、2-十四烷酮、异丁酸、癸酸、异胡酯酸甲酯、十六酸甲酯、异戊酸和4-甲基戊酸，以及异戊亚硝酸酯（表1）。相应的化学结构如图5所示。

图5. KRS009挥发性代谢物的鉴定。（A）使用GC-MS分析对照组和KRS009组中挥发性有机化合物（VOCs）的组成。（B）GC-MS鉴定化合物的结构式。

**表1. GC-MS分析的VOCs组成信息。**

| 峰 | 化合物 | CAS | 化学式 | SI(%) | RT | 峰面积 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 1-丁醇 | 71–36–3 | C?H??O | 94 | 7.865 | 6623,005,568 |
| 2 | 2-庚酮 | 110–43–0 | C?H??O | 91 | 8.330 | 85313,575 |
| 3 | 异戊醇 | 123–51–3 | C?H??O | 92 | 8.840 | 697199,618 |
| 4 | 戊烷 | 543–59–9 | C?H??Cl | 87 | 8.840 | 743199,618 |
| 5 | 2-辛酮 | 111–13–7 | C?H??O | 90 | 9.225 | 952283,065 |
| 6 | dl-次黄酸内酯 | 674–26–0 | C?H??O? | 85 | 9.510 | 1156262,348 |
| 7 | 2,3-丁二醇 | 513–85–9 | C?H??O? | 86 | 9.995 | 743235,714 |
| 8 | 2-壬酮 | 821–55–6 | C?H??O | 88 | 12.250 | 1052396,011 |
| 9 | 丙酮酸 | 127–17–3 | C?H?O? | 83 | 12.325 | 81216,829 |
| 10 | 2-十四烷酮 | 2345–27–9 | C??H??O | 80 | 13.600 | 1549524,019 |
| 11 | 异丁酸 | 79–31–2 | C?H?O? | 93 | 13.820 | 711786,170 |
| 12 | 癸酸 | 110–42–9 | C??H??O? | 93 | 14.810 | 1282329,138 |
| 13 | 异胡酯酸甲酯 | 5129–58–8 | C??H??O? | 87 | 14.810 | 1615329,138 |
| 14 | 十六酸甲酯 | 112–39–0 | C??H??O? | 88 | 14.810 | 1878329,138 |
| 15 | 异戊酸 | 503–74–2 | C?H??O? | 84 | 15.050 | 8113,388,108 |
| 16 | 4-甲基戊酸 | 646–07–1 | C?H??O? | 83 | 15.050 | 9103,388,108 |
| 17 | 异戊亚硝酸酯 | 110–46–3 | C?H??NO? | 83 | 15.050 | 6443,388,108 |

注：RT，保留时间；PA，峰面积；SI，相似度

基于GC-MS结果，并考虑其安全性和市场可获得性，选取了14种化合物，采用双密封平板法（针对VOCs）评估其拮抗活性。其中，包括丙酮酸和1-丁醇在内的十种化合物对*Botrytis cinerea*表现出100%的抑制率（图6A、B）。为进一步验证这十种化合物的抗真菌效果，本研究采用半最大有效浓度（EC??）测定法进行额外评估。如表2所示，4-甲基戊酸表现出最低的EC??值，在低浓度下对*Botrytis cinerea*表现出最强的抑制效果（图6C）。

图6. 单组分化合物对*Botrytis cinerea*的抑制作用。（A）各种化学物质对*Botrytis cinerea*的抑制效果。（B）各种化学物质对*Botrytis cinerea*的抑制率。（C）不同浓度化学物质对*Botrytis cinerea*的抑制率。误差线代表标准差。****代表根据非配对Student's t检验P < 0.0001的显著差异。

**表2. 具有潜在拮抗活性化合物的逻辑回归。**

| 化合物 | EC?? (μg/mL) | 逻辑回归（四参数） | R2 |
|---|---|---|---|
| 丙酮酸 | 107.35 | y = 4.6585x - 9.4606 | 0.718 |
| 1-丁醇 | 110.47 | y = 4.2713x - 8.7273 | 0.888 |
| 2-庚酮 | 679.13 | y = 12.4798x - 35.3423 | 0.978 |
| 异戊酸 | 5.36 | y = 3.4092x - 2.4867 | 0.940 |
| 异戊醇 | 219.95 | y = 1.9155x - 4.4868 | 0.784 |
| 4-甲基戊酸 | 2.91 | y = 3.5478x - 1.6447 | 0.986 |
| 2-壬酮 | 190.67 | y = 3.0237x - 6.8949 | 0.988 |
| 异丁酸 | 10.74 | y = 8.8616x - 9.1360 | 0.978 |
| 异戊亚硝酸酯 | 228.04 | y = 4.1023x - 9.6732 | 0.835 |

## 3.6 4-甲基戊酸是KRS009控制植物灰霉病的关键化合物

基于EC??结果，异戊酸、4-甲基戊酸和异丁酸三种化合物对*Botrytis cinerea*表现出较强的抑制作用，其中4-甲基戊酸效果最为显著。为进一步研究这些化合物在控制烟草灰霉病中的有效性及其诱导植物免疫的潜力，首先评估了它们对烟草植物的植物毒性。观察到用异戊酸和异丁酸处理的烟草叶片出现了黄化、萎蔫甚至死亡等症状。相比之下，4-甲基戊酸对烟草植物没有产生任何不良反应（图7A）。此外，4-甲基戊酸有效缓解了烟草灰霉病。当接种了*Botrytis cinerea*的烟草叶片经4-甲基戊酸熏蒸处理时，病斑直径与仅接种病原菌的对照组相比减少了10.67 mm。此外，仅接种病原菌组的真菌生物量是接种前经4-甲基戊酸熏蒸处理组的500倍（图7B、C）。与烟草免疫途径相关基因的表达分析显示，4-甲基戊酸熏蒸显著上调了与水杨酸（SA）信号通路相关基因的表达。

图7. 4-甲基戊酸有效控制烟草灰霉病。（A）对三种低EC??值化合物的安全性评估在烟草叶片上进行。（B）观察4-甲基戊酸处理的烟草叶片上*Botrytis cinerea*的病害症状。（C）病斑直径。（D）真菌相对生物量。（E）4-甲基戊酸增强烟草中与免疫相关基因的表达水平。（F）4-甲基戊酸上调烟草中与水杨酸信号通路相关基因的表达。（G）水杨酸标准溶液（50 ng/mL）的多反应监测（MRM）色谱图。紫色和绿色峰分别代表定量离子和定性离子。（H）烟草叶片中内源水杨酸含量的测定。（I）不同处理（CK、KRS009产生的VOCs或4-甲基戊酸）在0、7、14和21天时葡萄果皮pH值的变化。误差线代表标准差。*、**、***和****分别代表根据非配对Student's t检验P < 0.05、P < 0.01、P < 0.001和P < 0.0001的显著差异。柱上的字母表示基于一元方差分析后Duncan多重范围检验在0.05水平下的显著差异。

为进一步确认4-甲基戊酸对SA通路相关基因的影响，研究了在三种处理下烟草叶片中这些基因的表达水平：空白对照（CK）、喷洒10 μmol/L SA溶液和4-甲基戊酸熏蒸。结果表明，4-甲基戊酸熏蒸诱导的SA信号通路相关基因上调程度比SA溶液喷洒处理更为显著（图7D-F）。此外，内源SA含量的定量分析显示，在所检测的时间点，对照组和4-甲基戊酸处理的烟草叶片之间无显著差异（P > 0.05；图7G-H）。综上所述，这些结果表明4-甲基戊酸可能与SA相关的防御反应有关，表现为SA标记基因表达的上调，但在所测试条件下未观察到对内源SA水平的直接影响。

此外，由于4-甲基戊酸是一种有机酸，有必要排除其抗真菌活性仅仅是果实表面微环境酸化的结果这一可能性。因此，我们检测了KRS009 VOCs或4-甲基戊酸处理后葡萄果皮的pH值。结果表明，尽管4-甲基戊酸本身呈酸性，但在所有检测的时间点均未引起葡萄表面pH值的下降。事实上，三组中表面pH值在贮藏期间均逐渐升高（图7I）。综上所述，这些结果排除了抗真菌效果通过表面酸化介导的可能性，支持VOCs具有特定的生物活性而非pH依赖机制。

## 4. 讨论

灰霉病由腐生真菌*Botrytis cinerea*引起，是造成危害最大的采后病原菌之一。该病原菌能适应多变的环境条件，感染广泛的植物及其组织，并导致严重损失（Islam et al., 2024, Yin et al., 2023, Lucas et al., 2015）。其广泛的寄主范围、快速产生孢子的特性以及对传统杀菌剂产生抗性的倾向，已日益限制了化学防治的效果，同时引发了环境和食品安全方面的担忧。因此，开发安全高效的灰霉病管理策略具有重要意义（Zhang et al., 2026）。在此背景下，生物防治技术展现了可观的潜力，为采后腐烂病害的管理提供了独特优势。

芽孢杆菌属（*Bacillus*）中的细菌在植物病害的生物防治方面显示出良好的应用前景。例如，从番茄种子中分离的*Vegetobacillus velezensis* NEAU-CP5产生的挥发性有机化合物（VOCs）对*Botrytis cinerea*表现出76.86%的体外抑制率，并有效控制了菜豆的采后灰霉病（Bing et al., 2024）。类似地，从番茄根际分离的解淀粉芽孢杆菌（*Bacillus amyloliquefaciens*）菌株表现出促进植物生长和抑制灰霉病的双重功能（Rahman et al., 2025, Chen et al., 2025）。在我们先前的研究中，从健康棉花根际土壤分离出一株具有广谱拮抗活性的细菌菌株，鉴定为*mojavensis* KRS009，其VOCs对*Botrytis cinerea*的抑制率为88.32%（Zhao et al., 2024b）。此外，KRS009的次级代谢物破坏了病原菌的菌丝结构，并下调了与菌丝发育（BcHBF1、BcCYP2）和致病性（BcKMO、Bcser2）相关基因的表达。

我们使用RT-qPCR验证了参与黑色素合成、自噬和cAMP信号通路标记基因的表达，证实了KRS009产生的VOCs对烟草免疫的影响。

关于基因下调机制，我们提出了两种可能的解释：(1) 基因下调可能是挥发性有机化合物（VOCs）破坏细胞膜完整性所引发的继发后果，间接触发全局性转录重编程；(2) VOCs可能直接干扰调控生长和发育的特异性信号通路，如MAPK级联反应或cAMP/PKA通路。基于现有数据，我们无法明确区分这两种情况。我们承认，还需要进一步的目标性实验来明确VOCs的主要靶点，包括膜通透性测定和通路特异性分析。基于这些发现，本研究评估了KRS009产生的VOCs对本氏烟草灰霉病的生物防治效果，并测试了其对易感果蔬采后灰霉病的防控效果，包括葡萄、番茄和草莓。结果表明具有显著的防控效果，与先前的报道一致。葡萄是一种广泛种植的高价值经济作物，然而，其采后易受灰霉病侵害，导致品质下降和经济损失（Xie等，2024；Solairaj等，2020；Fillinger等，2012）。果蔬品质通常通过可溶性糖含量（SSC）、滴定酸度（TA）和可溶性蛋白含量等指标进行评估（Baca-Bocanegra等，2025；Alqarni和Bazzi，2019；Masithoh等，2016）。在本研究中，与对照相比，经KRS009 VOCs处理的葡萄在采后0–21天储存期间的SSC/TA比值显著降低，可溶性蛋白含量下降幅度也较小，表明该处理有助于保持果实品质并延长货架期。此外，处理的葡萄表现出总酚、类黄酮和花青素水平显著增加，这些酚类化合物对果实色泽和风味具有重要影响（Nedelkovski等，2025）。在抗氧化系统方面，处理后的葡萄中过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）等关键酶的活性显著增强，有助于减轻氧化损伤（Che等，2023）。同时，多酚氧化酶（PPO）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性增加表明抗病代谢通路的激活（Kong等，2024；Oosalo等，2024）。丙二醛（MDA）含量是膜脂过氧化的指标。对芽孢杆菌的综合研究表明，其VOCs显著降低了受灰葡萄孢菌感染的番茄叶片中的MDA含量，表明减轻了脂质过氧化并减少了植物的氧化损伤（Khan等，2025）。葡萄皮pH分析显示，与未处理对照相比，使用KRS009产生的VOCs或4-甲基戊酸处理均可不同程度地提高pH值，表明两种处理均能有效降低葡萄酸度。用天然VOCs熏蒸是替代合成杀菌剂防控采后病害的一种可行策略。先前的研究报告，微生物VOCs如2-甲基丁酸（2-MBA）可诱导樱桃番茄对灰葡萄孢菌的抗性（Liang等，2025）。此外，3-甲基-1-丁醇（3M1B）通过调节苯丙烷类和活性氧（ROS）代谢增强红葡萄的抗病性（Zhai等，2025）。同样，植物来源的VOCs 1-辛醇能有效抑制灰葡萄孢菌并防控葡萄和甜樱桃的灰霉病（Xu等，2025）。在本研究中，我们采用气相色谱-质谱联用（GC-MS）鉴定了KRS009 VOCs的成分，并测定了各化合物的半