《Poultry Science》：Quadruplex Real-time RT-qPCR for Simultaneous Detection and Subtyping of Avian Influenza Viruses and Avian Coronaviruses
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摘要：禽流感病毒（AIV）与禽冠状病毒（ACoV）是主要的禽类病原体，可通过候鸟传播，对家禽业和公共卫生构成重大威胁。高致病性禽流感病毒（HPAIVs）主要与H5亚型相关，而禽冠状病毒主要归属于Gamma属和Delta属。然而，目前的分子诊断方法大多局限于单靶
摘要：禽流感病毒（AIV）与禽冠状病毒（ACoV）是主要的禽类病原体，可通过候鸟传播，对家禽业和公共卫生构成重大威胁。高致病性禽流感病毒（HPAIVs）主要与H5亚型相关，而禽冠状病毒主要归属于Gamma属和Delta属。然而，目前的分子诊断方法大多局限于单靶标检测，阻碍了对多种病原体及高风险亚型的高效监测。本研究开发了一种四重TaqMan探针为基础的RT-qPCR检测方法，可在单一反应体系中同时检测AIV（M基因）、鉴定H5亚型（HA基因），并区分禽Gamma-及Delta-冠状病毒（RdRp基因）。该检测方法具备较高灵敏度，对AIV-M、H5（M+HA）及ACoV-Gamma的检测下限（LOD）为1拷贝/μL，对ACoV-Delta的检测下限为10拷贝/μL。在26种常见病原体中未观察到交叉反应，批内变异较低（CV < 2.83%），表明其具有较高特异性和可重复性。采用70份临床样本进行验证，结果显示与Sanger测序的一致性超过98.57%，可准确鉴定单一感染和混合感染。总体而言，该检测方法为多种禽类病毒的同步检测与监测提供了一个灵敏、特异且经济高效的平台。通过实现对共循环病原体的快速多重检测，该方法有助于家禽和野生鸟类病毒性疾病的早期预警与监测，并支持潜在人畜共患威胁的早期识别与控制。
**论文解读：四重RT-qPCR同步检测禽流感病毒与禽冠状病毒的方法开发与应用**
**一、研究背景与问题**
禽流感病毒（Avian Influenza Viruses, AIV）和禽冠状病毒（Avian Coronaviruses, ACoVs）是对家禽业和动物公共卫生构成重大威胁的两类病原体。AIV感染可导致家禽发生严重的呼吸道和全身性疾病，造成重大经济损失。尤其值得关注的是，某些AIV亚型，特别是高致病性H5亚型（如H5N1、H5N6），已被证实能够跨越物种屏障感染人类，且病死率较高，是具有大流行潜力的重要人畜共患病原体。世界卫生组织（WHO）数据显示，2003年至2023年间，全球23个国家共报告882例H5N1人间感染病例，其中461例死亡，估算病死率约52%。2024年3月，美国多个州的奶牛群中检出H5N1病毒，随后在未消毒牛奶中检测到高病毒载量，并报告了奶牛场工人感染及家猫死亡事件，进一步凸显了H5N1跨多种宿主动物传播的广泛人畜共患威胁。
目前已知的ACoVs主要感染家禽和野生鸟类，归属于Gamma属和Delta属。Gamma-ACoVs在家禽中广泛分布，常与传染性支气管炎病毒（Infectious Bronchitis Virus, IBV）等呼吸道或肠道疾病相关；Delta-ACoVs则在多种野生鸟类中被检出，宿主多样性更高，并可能通过候鸟传播。例如，猪三角洲冠状病毒（Porcine Deltacoronavirus, PDCoV）已在麻雀和鹌鹑等候鸟中检出，并显示出跨越猪、牛、鸡等广泛宿主范围的能力，其在海地儿童中的感染报道进一步提示Delta冠状病毒存在跨物种传播和人畜共患外溢的潜在风险。
日益增多的监测研究表明，AIV与ACoVs在同一生态位中频繁共循环，甚至可在同一地区、同一时段或同一份样本中被同时检出。例如，摩洛哥商品肉鸡场2021至2023年间的监测数据显示，IBV（一种代表性禽Gamma冠状病毒）与低致病性禽流感病毒（LPAIV）H9N2的鸡群共感染率为12.57%，在2022年的并发疫情期间升高至17%，共感染鸡群表现出更严重的呼吸道病变和显著升高的死亡率。在东亚-澳大利西亚候鸟迁徙路线上的关键中途停歇地，2021至2022年上海采集的鸟类样本中，AIV与ACoV总体共感染率为3.3%，且38.9%的ACoV阳性鸟类同时为AIV阳性。这些流行病学特征强调了在监测计划中同时检测和区分AIV与ACoVs的必要性。
实时逆转录定量PCR（RT-qPCR）因其高灵敏度和特异性，已成为检测AIV和ACoVs的首选方法。然而，现有诊断策略在整合检测和基因分型方面仍有局限。AIV检测通常以高度保守的基质蛋白（M）基因作为通用标志物，而H5等高风险亚型的鉴定需要额外针对血凝素（HA）基因的检测。能够同时区分AIV和ACoVs的方法仍然有限，往往需要多个独立反应，增加了诊断成本、试剂消耗和操作复杂性，同时降低了检测效率。已有的少数整合检测方法，如MALDI-TOF核酸质谱法虽可同时检测包括多种AIV亚型、新城疫病毒（NDV）和IBV在内的十种主要禽类病原体，但需要专门且较为昂贵的仪器，操作复杂耗时，且未纳入ACoV靶标或谱系区分。商业化的禽类病毒核酸检测试剂盒也主要设计为针对AIV和NDV的双重荧光PCR，多数试剂盒未整合ACoV检测或实现高致病性H5病毒的谱系级区分。
**二、研究目标与研究内容**
为解决上述问题，本研究旨在开发一种四重TaqMan探针为基础的RT-qPCR检测方法，将AIV通用标志物（M基因）、高致病性亚型标志物（H5-HA基因）以及两大类ACoV群的特异性靶标整合到单一反应体系中。该检测方法可实现AIV的同步检测、高致病性H5亚型的鉴定以及Gamma-和Delta-ACoVs的区分，同时保持与传统RT-qPCR方法相当的灵敏度和特异性，显著提高检测效率并降低成本。
**三、主要技术方法概述**
研究人员从GISAID和GenBank数据库获取AIV的M和HA基因全长序列以及禽Gamma-和Delta-CoV的RdRp基因序列，使用Geneious Prime 2025.0.2进行多序列比对（MSA），并用MEGA7构建系统发育树以评估代表性毒株间的遗传关系。基于比对结果设计引物和探针，四个靶标探针分别以NED、ROX、FAM和VIC荧光基团标记。将H5阳性AIV样本、Gamma-和Delta阳性ACoV样本的RNA逆转录为cDNA，扩增含T7启动子的保守区片段并进行体外转录制备RNA标准品。通过单重与多重反应比较评估四个荧光通道间的光谱重叠和干扰。系统优化双重及四重RT-qPCR的引物浓度和比例。采用连续10倍稀释的RNA标准品确定检测下限（LOD）并建立标准曲线，通过20次重复反应评估重复性（CV值），利用21种国家参考标准呼吸道病原体和5株实验室保存病毒株评估特异性，通过五种模拟共感染模型评估共感染检测能力，最后使用70份来自上海和浙江的野生鸟类及家禽临床样本（咽拭子/泄殖腔拭子及粪便）进行验证，并与Sanger测序结果进行一致性比较。所有检测均在华东师范大学生物安全二级（BSL-2）实验室进行。
**四、研究结果**
**1. 序列分析与引物/探针设计**
多序列比对和系统发育分析结果显示，AIV的M基因相对保守，遗传分化程度较低；HA基因变异程度较高，但H5亚型内的HA基因相对保守，并形成独立进化支。ACoV的RdRp基因清晰分为Gamma和Delta两大谱系。由于AIV H5亚型HA基因和ACoV RdRp基因的保守序列较短，研究人员在这些靶标的探针中引入MGB修饰以提高短寡核苷酸的熔解温度（Tm）。
**2. 双重RT-qPCR验证**
从AIV-H5、ACoV-Gamma和ACoV-Delta样本中成功扩增出AIV-M、AIV-H5-HA和ACoV-RdRp基因的保守区，并通过体外转录生成RNA标准品。退火温度优化结果显示58°C为所有靶标的最佳退火温度。无逆转录（NRT）对照未检测到扩增信号，证实无DNA污染。
**3. 荧光通道兼容性与引物比例优化**
单重与多重反应比较显示，每个靶标在对应检测通道的荧光信号显著高于其他三个通道，表明四个荧光团之间无明显光谱重叠或信号干扰。在AIV-M/AIV-H5-HA双重系统中，当两种引物均以0.4 μmol/L终浓度使用时性能最佳。在ACoV-Gamma/Delta双重系统中，最优条件为ACoV-Gamma引物0.4 μmol/L和ACoV-Delta引物0.3 μmol/L。四重检测中，AIV引物混合物与ACoV引物混合物以1.0 μL:1.0 μL比例混合时所有靶标均表现出较高的扩增效率和灵敏度。
**4. LOD评估与标准曲线构建**
在四重RT-qPCR系统中，AIV-M、AIV-H5（M+HA）及ACoV-Gamma的LOD均达到1拷贝/μL，ACoV-Delta的LOD为10拷贝/μL。四个靶标在其各自稀释范围内均表现出良好的线性关系，R2分别为0.9926、0.9921、0.9975和0.9982，扩增效率分别为104.2%、100.6%、93.6%和90.5%。
**5. 重复性、特异性与共感染分析**
三个独立批次（每批20次技术重复）的重复性评估显示，批间CV值范围为0.52%至2.83%，均低于3%，确认了良好的批间可重复性。特异性评估结果显示，甲型流感病毒的5个亚型（H7N9、H5N1、H1N1、H3N2和H9N2）和ACoV阳性对照产生预期的阳性扩增信号，其余17种非靶标病原体未检测到扩增信号。五种模拟共感染模型的灵敏度分析显示，在最低靶标浓度100拷贝/μL时，四种共感染模型中所有靶标均能稳定检出；当浓度降至10拷贝/μL时，相应靶标仍可通过阳性信号检出，且未观察到非靶标病原体的假阳性扩增。
**6. 临床验证**
使用70份来自上海和浙江的野生鸟类及家禽临床样本进行验证。四重RT-qPCR对AIV-M、AIV-H5-HA和ACoV-Delta的检测准确率均为100%（70/70），对ACoV-Gamma的准确率为98.57%（69/70）。其中一个ACoV-Gamma阳性样本未被检出（26/27）。所有四个靶标的Kappa值均高于0.970。其中，共鉴定出19份双重靶标共感染样本。
**五、讨论与结论**
AIV和ACoV是影响家禽健康的重要病原体，在自然生态系统中常在野生鸟类和家禽间共循环。候鸟迁徙和家禽养殖密度增加进一步促进病毒传播和遗传多样化，偶尔导致高致病性和人畜共患亚型的出现，如AIV的H5N1和H5N6亚型。共感染可能增加疾病严重程度，SPF鸡模型中IBV与H9N2 AIV共感染将发病率提高至60%-70%，死亡率提高至10%-20%，而单一病毒感染未导致死亡。共感染还为病毒重组和重配创造了机会，增加了跨物种外溢的风险。例如，DuCoV_2714被证明源于候鸟源DuCoV_NL3与鸡源IBV的重组，而PDCoV据报道可感染猪并随后感染人类。
本研究中建立的四重RT-qPCR方法，AIV-M、H5-HA和ACoV-Gamma的LOD为1拷贝/μL，ACoV-Delta的LOD为10拷贝/μL，后者灵敏度较低主要归因于其引物/探针Tm相对较低，以及Delta区域变异较大。尽管存在这一差异，所有靶标在标准曲线中均表现出良好的线性和扩增效率，证实了可靠的定量性能。临床验证中唯一漏检的ACoV-Gamma样本在单重RT-qPCR中Ct值为37.22，表明四重检测方法在低病毒载量下的灵敏度有所折衷。
该检测方法可应用于不同层面的禽病毒监测：候鸟迁徙监测中的大规模样本高通量筛选、活禽市场的多种重要禽病毒快速筛查、以及家禽养殖场的常规健康监测。本研究共鉴定出19份临床共感染样本，凸显了同时监测多种病毒病原体而非依赖单一病原体检测的重要性。
研究局限性包括：仅覆盖H5亚型而不含H7和H9等其他流行病学重要亚型；虽可区分Gamma-和Delta-冠状病毒但无法提供进一步亚型或谱系鉴定；临床验证样本量相对较小（70份）；MGB探针增加寡核苷酸合成成本。未来研究应着重扩大检测面板以纳入更多高优先级AIV亚型，增加临床样本数量和多样性，并探索替代探针设计或其他成本效益更高的检测化学方法。
研究结论：本研究开发的四重RT-qPCR检测方法能够在单一反应中同时检测AIV及其H5亚型，并区分Gamma-和Delta-ACoVs。凭借其高灵敏度、高特异性及可靠的共感染检测性能，该方法为多种禽类病毒的同步检测和综合监测提供了灵敏、特异且经济高效的平台，有助于家禽和野生鸟类病毒性疾病的早期预警，支持潜在人畜共患威胁的监测与防控。
