综述：超分辨光学显微镜的最新进展

《Science Bulletin》：Recent advances in super-resolution optical microscopy

　　

摘要 在过去几年中，超分辨率（SR）光学显微镜在仪器和计算方法论方面均取得了 rapid 进展。本综述总结了主要超分辨率光学显微镜技术的最新进展，包括单分子定位显微镜、结构光照明显微镜和受激发射损耗显微镜，重点介绍了其在空间分辨率、通量、成像深度、采集速度和重建保真度方面的提升。文章讨论了在实施方案、标记策略和图像分析方面的创新，以及它们克服超分辨率显微镜关键局限性的潜力。最后，概述了超分辨率显微镜持续存在的瓶颈和未来展望。这些进展有望进一步扩大超分辨率显微镜在生命科学、材料科学和转化生物医学研究中的影响。

引言

光学显微镜作为一种微创性低、通过荧光标记具有高特异性且兼容活细胞成像的工具，长期以来一直是探索微观结构不可或缺的工具。自诞生以来，它在推动我们对生物组织结构和动态过程的理解方面发挥了核心作用。然而，传统光学显微镜从根本上受到衍射极限的制约，该极限将空间分辨率限制在约200纳米，从而无法直接可视化纳米级结构和分子组装体。为克服这一局限，超分辨率（SR）光学显微镜在过去三十年中取得了 remarkable 发展[1]、[2]。包括单分子定位显微镜（SMLM）[3]、受激发射损耗显微镜（STED）[4]和结构光照明显微镜（SIM）[5]在内的主要技术已成功突破经典衍射极限，实现了纳米级精度的成像。这些进展革新了光学成像技术，使得在活体系统中直接观察亚细胞结构和分子相互作用成为可能。其深远影响获得了2014年诺贝尔化学奖的肯定。

尽管取得了这些变革性进展，超分辨率显微镜仍面临着日益增长的生物学应用需求带来的若干持续挑战。首先，虽然空间分辨率已超越衍射极限一个数量级以上，但若要实现常规分子级分辨率仍需进一步提升。其次，高通量成像对于全面表征异质性细胞群体和复杂分子组装体至关重要。第三，多重成像能力对于在同一标本中同时实现多个靶标的纳米级可视化变得越来越必要。第四，实时生物观察既需要更快的图像采集也需要快速的计算重建。最后，对厚度和高散射生物标本的可靠成像仍然具有挑战性，需要背景抑制、像差校正和自适应光学策略。

为应对这些挑战，人们投入了大量努力推进超分辨率显微镜的硬件和计算基础。在光学系统设计、荧光标记策略和图像重建算法方面的创新共同扩展了现代超分辨率技术的性能边界。同时，机器学习的集成显著加速了图像重建并增强了重建保真度。

本综述总结了主要超分辨率光学显微镜的最新进展，涵盖成熟模式（SMLM、STED和SIM）、新兴混合方法、深度学习驱动增强、荧光团工程和标记策略。我们提供了关键技术间的比较评估，以便为特定生物学应用提供基于证据的选择依据。最后，我们讨论了当前局限并展望了推进超分辨率光学显微镜的研究方向。

章节摘要

超分辨率光学显微镜技术

"超分辨率"一词指超越物理衍射极限的分辨率提升——表达为λ/(2nsinα)——其中λ为成像波长，n为浸没介质的折射率，α为物镜收集光的最大半角。这一基本极限最初由恩斯特·阿贝推导，长期以来被视为不可逾越的物理约束，三个多世纪以来无人质疑，直到20世纪90年代的突破才使其得以突破。

讨论与结论

在过去几十年中，SR光学显微镜在多个方向上取得了 remarkable 改进。在光学系统设计、照明工程、标记策略和计算图像重建方面的进展共同推动了空间分辨率、成像通量、穿透深度和时间分辨率的实质性提升。与此同时，日益复杂的计算方法显著增强了重建保真度，

利益冲突

作者声明不存在利益冲突。

致谢

本文献给格尔·乌尔里希·尼恩豪斯教授，以纪念他在卡尔斯鲁厄理工学院（KIT）度过四十余载卓越的生物物理和生物成像研究后光荣退休。作者感谢中国国家重点研发计划（2024YFF0507202）的支持；国家自然科学基金委（62505242, 62335018, 62575230, 12504392, 62405246, 61927810, 62375116）；科研创新能力支持

高鹏|戴斯情|李明扬