基于染色体片段置换系群体的白菜型油菜种子休眠数量性状位点定位

《Scientia Horticulturae》：Mapping of quantitative trait loci for seed dormancy in Brassica rapa based on a chromosome segment substitution lines population

　　

种子休眠是直接影响种子萌发和作物产量的关键农艺性状。在本研究中，研究人员以‘49caixin’（强休眠）为轮回亲本、‘Chiifu’（弱休眠）为供体亲本，构建了白菜型油菜（Brassica rapa）的染色体片段置换系（chromosome segment substitution line, CSSL）群体。通过多季表型鉴定和数量性状位点（quantitative trait locus, QTL）定位，检测到7个与休眠相关的QTL，其中位于A05染色体上的主效位点qD-5-1在不同环境中稳定表达。利用来源于CFIL506ב49caixin’的F₂群体，将qD-5-1定位在标记Y506-186与Y506-238之间约2 Mb的区间内。基于标记Y506-186和Y506-238，在F₂群体中，‘Chiifu’基因型具有比‘49caixin’基因型更高的GA₃含量和更低的ABA含量。表达和序列分析鉴定出三个推定靶基因：Bra022368、Bra022166和Bra022221，它们参与激素信号转导和胁迫响应。这些发现阐明了白菜型油菜种子休眠的遗传基础，为通过休眠调控育种改善出苗整齐度和穗发芽抗性提供了关键位点和潜在靶基因。

种子休眠是指具有活力的种子在适宜萌发条件下暂时保持不萌发状态的重要农艺性状。休眠程度直接影响田间出苗率和种子贮藏性能，过强导致出苗不齐，过弱则易发生穗发芽，造成产量和品质损失。休眠与萌发受遗传和环境信号共同调控，核心在于赤霉素（GA₃）与脱落酸（ABA）的动态平衡。目前，在拟南芥、水稻等植物中已克隆了多个休眠相关基因（如DOG1），但在白菜型油菜（Brassica rapa）中，种子休眠的QTL定位仍处于初步阶段，功能基因尚不明确。为此，研究人员以强休眠品种‘49caixin’为轮回亲本、弱休眠品种‘Chiifu’为供体亲本，构建了染色体片段置换系（CSSL）群体，开展种子休眠QTL定位与候选基因筛选。该论文发表于《Scientia Horticulturae》。

研究人员通过多代回交和自交结合分子标记辅助选择（MAS）构建了75个CSSL系，覆盖供体基因组81.02%。通过多季表型鉴定和QTL定位，检测到7个休眠相关QTL，其中主效位点qD-5-1在A05染色体上稳定表达。利用CSSL系CFIL506与‘49caixin’杂交构建F₂群体，将qD-5-1精细定位至约2 Mb区间，进一步测定该区间内候选基因的表达与序列变异，最终鉴定出3个推定靶基因。主要技术方法包括：CSSL群体构建与图形基因型分析；标准发芽试验评估休眠表型；Dunnett’s t检验和ICIMapping软件进行QTL检测；通过F₂群体进行精细定位；采用超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）测定内源ABA和GA₃含量；利用qRT-PCR和基因克隆测序分析候选基因表达及序列多态性。所有植物材料均种植于沈阳农业大学温室。

### 3.1 不同世代染色体置换片段的比较分析

通过多世代回交和自交，CSSL群体的片段组成逐渐纯合化。在BC₁₀F₃代，单片段置换系数量增至66个，遗传背景恢复率达98.06%，基因组覆盖率为81.02%。

### 3.2 CSSL群体置换片段的基因组覆盖度

分子标记分析显示，75个CSSL系中导入的供体片段均匀分布于10条染色体，总长度为458.57 Mb，目标导入片段为208.46 Mb，各染色体覆盖率为63.13%～97.10%，平均81.02%。

### 3.3 供体亲本‘Chiifu’与受体亲本‘49caixin’的休眠特性

通过不同年份和收获时期的发芽试验，确定了冬季收获后60天、室温贮藏1周为评价‘49caixin’休眠的适宜条件。‘Chiifu’基本无休眠，而‘49caixin’呈现强休眠，F₁代发芽率介于双亲之间，表明该性状为部分显性。

### 3.4 CSSL群体种子休眠的表型鉴定与QTL分析

在两个生长季节共筛选出7个与‘49caixin’发芽率差异极显著的CSSL系，对应7个QTL（qD-1-1、qD-3-1、qD-3-2、qD-5-1、qD-5-2、qD-9-1和qD-10-1），加性效应为9.33%～41.33%。其中CFIL506仅改变种子休眠，无其他农艺性状负面影响，故选作精细定位材料。

### 3.5 通过CFIL506与‘49caixin’杂交的F₂群体进行qD-5-1的遗传分析

对F₂群体进行基因分型和发芽率统计，qD-5-1被稳定定位在A05染色体标记Y506-186和Y506-238之间约2 Mb区间。携带‘Chiifu’等位基因的植株发芽率显著高于‘49caixin’纯合型，杂合型居中，表明该位点通过降低休眠促进萌发。

### 3.6 F₂群体内源ABA和GA₃的测定

采用UPLC-MS/MS测定两种基因型种子的激素含量，结果显示‘Chiifu’基因型种子GA₃含量约为‘49caixin’基因型的3倍，而ABA含量显著低于‘49caixin’基因型，与表型一致。

### 3.7 qD-5-1区间推定靶基因的筛选与鉴定

在qD-5-1区间内注释到239个基因，经功能注释和同源比对初筛出12个候选基因。qRT-PCR显示其中4个（Bra022368、Bra022166、Bra022221、Bra027219）在双亲间表达差异显著；克隆测序排除了序列一致的Bra027219，最终确定Bra022368（核酸结合OB折叠样蛋白）、Bra022166（蛋白磷酸酶2C家族蛋白）和Bra022221（胚胎发育晚期丰富蛋白）为推定靶基因。

讨论部分指出，CSSL群体因遗传背景均一、片段界定清晰，是QTL定位的理想材料；亚种间杂交丰富了遗传变异。qD-5-1属于主效QTL，其区间内可能存在一因多效或基因簇。ABA和GA₃的激素平衡是休眠调控的核心，qD-5-1等位变异可能通过影响激素积累模式来改变休眠强度，但还需转基因互补、基因编辑等功能验证。三个候选基因分别参与ABA信号负调控、胚胎发育和胁迫响应及核酸结合，可能协同调控休眠。研究也存在标记密度有限、候选区间较大等局限，未来将利用更大群体、BSA-seq、转录组和CRISPR/Cas9基因编辑进一步验证。

本研究利用高质量的CSSL群体，在白菜型油菜中鉴定出一个稳定表达的主效QTL qD-5-1，并将其精细定位于A05染色体约2.0 Mb的区间。qD-5-1位点上来自‘Chiifu’的等位基因通过提高GA₃含量和降低ABA含量来降低休眠、促进萌发，而‘49caixin’等位基因则维持强休眠。基于这些结果，研究人员提出Bra022368、Bra022166和Bra022221三个关键候选基因作为该性状的潜在调控因子。这些发现阐明了种子休眠的遗传和生理基础，为通过分子育种改善白菜型油菜出苗整齐度和穗发芽抗性提供了可靠的位点和基因。