R2R3-MYB转录抑制因子CaMYB330负调控辣椒中的花青素生物合成

《Scientia Horticulturae》：The R2R3-MYB transcriptional repressor CaMYB330 negatively regulates anthocyanin biosynthesis in pepper

　　

### 问题三：论文摘要翻译

花青素是类黄酮途径的重要次生代谢物，有助于植物着色、胁迫响应，并对人类健康有益。在辣椒（*Capsicum annuum* L.）中，参与花青素生物合成的激活型MYB转录因子已被广泛报道，而抑制型MYB的作用仍知之甚少。在本研究中，研究人员鉴定到一个R2R3-MYB转录抑制因子CaMYB330。表达分析显示，*CaMYB330*的转录水平与花青素积累呈显著负相关。过表达*CaMYB330*抑制了关键花青素结构基因（如*CaDFR*、*CaANS*和*CaUFGT*）的表达，而沉默*CaMYB330*则促进了辣椒叶片中的花青素积累。在机制上，CaMYB330通过两种模式调控花青素生物合成：（i）直接结合并抑制结构基因的启动子，从而降低其表达；（ii）与激活因子CaMYBA竞争性结合CaMYC，削弱CaMYBA–CaMYC复合物的活性。此外，光响应转录因子CaHY5能够结合*CaMYB330*启动子并抑制其表达，从而在光照条件下解除CaMYB330的抑制作用，促进花青素的生物合成。总而言之，这些发现表明CaMYB330在辣椒叶片中作为花青素生物合成的负调控因子发挥作用。此外，该研究支持了CaHY5–CaMYB330调控模块的存在，为辣椒色泽改良和分子育种策略提供了新的见解。

### 问题四：论文主体内容解读

#### 一、 研究背景与意义

花青素是一类广泛分布于自然界的水溶性天然色素，作为类黄酮生物合成途径的终产物之一，不仅赋予植物丰富多彩的颜色，还在种子传播、抵抗逆境胁迫以及保护植物免受高光（尤其是UV-B和蓝光）引起的氧化损伤等方面发挥重要作用。对人类而言，花青素也具有抗氧化、抗炎、保护心血管及抗肿瘤等多种生理益处，因此研究其生物合成及调控机制具有重要意义。花青素的生物合成受到由MYB、bHLH和WD40蛋白组成的MBW转录复合物的精细调控，其中MYB转录因子在该调控网络中扮演核心角色。在辣椒中，已鉴定出多个 positively 调控花青素生物合成的MYB转录因子（如CaMYBA、CaMYB5等），然而负调控因子，特别是抑制型MYB在辣椒花青素代谢中的作用和机制尚不清楚。此外，光是影响花青素积累的关键环境因素，其信号通过CaHY5等关键枢纽转录因子传递，但CaHY5调控花青素产生的详细分子机制仍未完全阐明。因此，揭示辣椒中花青素生物合成的负调控机制，并将其整合到光信号调控网络中，对于理解植物如何精确调节次生代谢过程以及指导辣椒色泽改良和分子育种具有重要意义。

#### 二、 主要技术方法

本研究利用多种分子生物学和生物化学技术，系统阐明了CaMYB330的功能机制。主要技术方法包括：利用qRT-PCR分析基因表达模式；通过系统进化分析和多序列比对鉴定CaMYB330的序列特征；借助亚细胞定位分析和酵母转录激活实验验证其蛋白特性；在烟草和辣椒中进行瞬时过表达、病毒诱导基因沉默（VIGS）以及烟草稳定遗传转化，进行体内功能验证；运用酵母单杂交（Y1H）和双荧光素酶报告基因实验检测蛋白与启动子的结合及转录调控活性；使用酵母双杂交（Y2H）、双分子荧光互补（BiFC）和荧光素酶互补成像（LCI）实验验证蛋白间的相互作用。植物材料包括三个辣椒品种‘Purple Pepper’、‘P127’和‘Ziyan’，以及本氏烟草（*Nicotiana benthamiana*）。

#### 三、 核心研究结果

**1. CaMYB330的表达与辣椒花青素积累相关**
研究人员对‘P43’辣椒材料中出现的白化和紫色叶片进行转录组测序分析，发现花青素结构基因和调节基因在紫色叶片中高表达，而*CaMYB330*（Capana00g004862）的表达模式与它们相反。进一步的qRT-PCR分析表明，在‘Purple Pepper’和‘Ziyan’两个品种的不同组织（叶、芽、果）和发育阶段中，*CaMYB330*的转录水平都与花青素的积累呈显著的负相关，表明它可能是一个负调控因子。

**2. CaMYB330的鉴定与序列分析**
序列分析显示，*CaMYB330*的CDS长度为858 bp，编码285个氨基酸。系统进化分析表明CaMYB330属于R2R3-MYB亚家族4（SG4），与AtMYB3、AtMYB4、AmMYB308和MdMYB3等已知的抑制因子聚为一支。多序列比对发现其N端含有保守的R2R3结构域和一个bHLH互作基序，C端则含有典型的类黄酮抑制因子基序C1和C2。亚细胞定位实验显示CaMYB330定位于细胞核。酵母转录激活实验证明CaMYB330不具有转录激活活性。

**3. CaMYB330在烟草中抑制花青素积累**
在烟草中的瞬时共表达实验显示，CaMYB330与激活因子CaMYBA共浸润能显著降低烟草叶片中花青素的积累和花青素结构基因（如*NtCHS*、*NtDFR*、*NtANS*等）的表达水平。此外，通过稳定遗传转化获得CaMYB330过表达的转基因烟草，其花瓣颜色由野生型的粉红色变为纯白色，花青素含量显著降低，同时花青素生物合成结构基因的转录水平也明显下调。这些结果表明CaMYB330在异源系统中能有效抑制花青素的合成。

**4. CaMYB330在辣椒中抑制花青素合成**
在‘Purple Pepper’叶片中瞬时过表达*CaMYB330*，导致花青素含量降低，并显著抑制了*CaMYC*、*CaCHS*、*CaF3H*、*CaDFR*、*CaANS*和*CaUFGT*等基因的表达，而*CaMYBA*的表达未见显著变化。相反，利用VIGS技术沉默*CaMYB330*后，辣椒叶片出现明显的紫色色素沉着，花青素含量显著增加，花青素合成相关基因的表达水平也大幅上调。这进一步证实了CaMYB330在辣椒中作为花青素合成负调控因子的功能。

**5. CaMYB330直接结合花青素合成相关基因启动子并抑制其表达**
通过双荧光素酶报告实验证实，CaMYB330能够抑制*CaDFR*、*CaF3′5′H*和*CaUFGT*的启动子活性，但对其他测试的启动子（包括*CaMYBA*和*CaMYC*）没有明显抑制作用。酵母单杂交（Y1H）实验进一步证实CaMYB330能够直接结合到这些靶基因的启动子上。这揭示了CaMYB330通过直接结合并抑制关键结构基因启动子来发挥其抑制功能。

**6. CaMYB330的抑制功能依赖于其抑制基序**
研究发现，删除C1或C2基序的CaMYB330突变体（CaMYB330-△C1和CaMYB330-△C2）对*CaDFR*、*CaF3′5′H*和*CaUFGT*启动子的抑制作用减弱，其中△C1突变体的影响更为显著。在烟草共浸润实验中，△C1突变体也表现出更明显的色素恢复，表明C1基序在CaMYB330的抑制功能中起主导作用。序列分析发现其C2基序不完全（IxLxL而非LxLxL），将205位异亮氨酸（I）突变为亮氨酸（L）恢复基序后，C2基序的抑制功能增强，这解释了C1基序占主导的原因。

**7. CaMYB330与CaMYC蛋白发生相互作用**
酵母双杂交（Y2H）、双分子荧光互补（BiFC）和荧光素酶互补成像（LCI）实验均证实CaMYB330能够与bHLH家族成员CaMYC发生物理相互作用，这种互作依赖于其bHLH互作基序。

**8. CaMYB330干扰CaMYBA–CaMYC复合物的功能**
竞争性荧光素酶互补实验表明，CaMYB330能显著降低CaMYBA与CaMYC之间的相互作用强度。双荧光素酶实验发现，CaMYB330能抑制CaMYBA–CaMYC复合物对*CaDFR*和*CaF3H*启动子的激活作用，且这种抑制作用呈现剂量依赖效应。当bHLH基序被截除后，CaMYB330丧失与CaMYC互作的能力，其对花青素积累的抑制作用也显著减弱。这证明CaMYB330通过与激活因子竞争性结合CaMYC，从而干扰MBW复合物的转录激活功能。

**9. CaHY5通过抑制CaMYB330表达正向调控花青素合成**
生信分析发现*CaMYB330*启动子区域含有推定的CaHY5结合位点（ACE元件）。光照处理实验显示，随着光照时间延长，*CaHY5*的表达上升而*CaMYB330*的表达下降，二者表达模式相反。Y1H和双荧光素酶实验证实，CaHY5能够直接结合*CaMYB330*的启动子并抑制其转录活性。

#### 四、 讨论与结论总结

**讨论分析**：研究将CaMYB330的负调控机制与光信号通路联系起来。在光照条件下，CaHY5作为光信号的核心枢纽，直接抑制抑制因子*CaMYB330*的表达，从而解除其对花青素合成结构基因和MBW复合物的双重抑制作用，最终促进花青素的积累。这一机制与在月季中发现的RhHY5调控RhMYB3b/RhMYB114a的模式相似，表明通过光信号抑制负调控因子是植物中一种保守的精细调控策略。研究还讨论了CaMYB330不与CaMYBA形成反馈调节，而是特异性靶向调控后期结构基因（如*CaDFR*、*CaF3′5′H*、*CaUFGT*），这种机制可以避免对整个类黄酮代谢流产生过度干扰，有利于植物在生长和色素积累间维持平衡。

**研究结论**：本研究首次揭示了辣椒中R2R3-MYB转录抑制因子CaMYB330负调控花青素生物合成的双重分子机制：一是通过其C1主要抑制基序直接结合并抑制结构基因（*CaDFR*、*CaF3′5′H*、*CaUFGT*）的启动子；二是通过其bHLH基序与激活因子CaMYBA竞争性结合CaMYC，从而干扰CaMYBA–CaMYC激活复合物的功能。此外，研究还阐明了光信号通过CaHY5–CaMYB330调控模块促进花青素合成的机制，即CaHY5抑制*CaMYB330*的表达，解除其阻遏作用。这项研究完善了辣椒花青素生物合成的转录调控网络，为辣椒叶片色泽改良和果实颜色分子育种提供了新的理论依据和候选基因。