《Scientia Horticulturae》：In silico identification of novel intergenic small open reading frames in the watermelon genome and their potential roles in stress response
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小开放阅读框（sORFs，编码30–100个氨基酸的肽段）被传统基因预测流程系统性排除，然而新出现的证据表明其产物参与植物的发育、信号传导及逆境适应。端粒到端粒（T2T）无缺口组装的西瓜（Citrullus lanatus）基因组97103 v3版本的最新发布
小开放阅读框（sORFs，编码30–100个氨基酸的肽段）被传统基因预测流程系统性排除，然而新出现的证据表明其产物参与植物的发育、信号传导及逆境适应。端粒到端粒（T2T）无缺口组装的西瓜（Citrullus lanatus）基因组97103 v3版本的最新发布，为探查西瓜中此前无法访问的基因间区域提供了前所未有的机遇。研究人员将六框开放阅读框扫描（EMBOSS getorf）与两阶段纯化流程相结合，构建了首个西瓜新型基因间sORF全基因组目录，共获得143,288条非冗余序列，其在两条链上呈近似对称分布。以362个核糖体相关基因作为参考 panel 进行密码子适应指数（CAI）分析，在CAI ≥ 0.7阈值下保留了134,887个nsORFs（94.14%）；相对同义密码子使用（RSCU）分析鉴定出24个在nsORF集合与核糖体参考集中均过度代表的密码子，表明其与宿主翻译机器具有显著的相容性。Infernal–Rfam扫描显示，仅1.22%通过CAI筛选的nsORFs与已注释非编码RNA家族存在重叠，其中miRNA相关匹配以发育及逆境相关家族为主（miR156/166/169/171/393/399/408）。亚细胞运输推断揭示了异质性架构（核输出信号NES，n = 39,216 ? 核定位信号NLS，n = 8,855 ? 信号肽SP，n = 429），同时发现一个同时携带SP、NLS和NES的罕见"三信号"六元组。对覆盖六种生物和非生物逆境条件（干旱、弱光、盐碱、根结线虫、CGMMV-硼复合处理及白粉病）的134个RNA-seq文库进行重新分析，鉴定出18,625个具有转录活性的nsORFs（TPM ≥ 1），30组DESeq2对比揭示了逆境特异的差异表达程序，其中干旱和线虫侵染下的转录重编程最为显著。针对四种主要西瓜病原体的PredHPI筛选，结合FFPred4和MULocDeep分析，优先确定了五个高优先级宿主-病原互作候选序列（wlsORF1–wlsORF5；53–86个氨基酸）供进一步研究。这些候选序列被预测具有跨膜特征，并被赋予涵盖转运蛋白、激酶、转录因子、细胞因子样及ATP结合类别的推定功能注释，提示其可能参与细胞器膜相关及电子传递过程。综上，本研究提供了首个T2T锚定的西瓜nsORF资源，并构建了涵盖序列组成、转录参与及预测互作组的分层证据框架，为葫芦科作物中靶向微肽的育种策略奠定基础。
**西瓜基因间小开放阅读框全基因组鉴定及其逆境应答潜能的系统研究**
**1. 研究背景与科学问题**
长期以来，"基因数目-复杂性悖论"一直是基因组学领域的核心争论之一。人类基因组最初预计包含超过10万个蛋白编码基因，但最终完成图显示实际数量仅为预测值的约四分之一。传统观点将这一差异主要归因于上位互作、可变剪接和非编码调控元件，然而越来越多的证据表明，大量功能性编码序列——尤其是小尺寸编码序列——在基因组注释中被系统性遗漏。绝大多数基因预测流程设置了300个核苷酸（nt）的长度阈值，导致编码30–100个氨基酸肽段的小开放阅读框（small open reading frames, sORFs）被系统性排除。然而，在酿酒酵母、果蝇、秀丽隐杆线虫以及拟南芥、玉米等植物中，大量sORF已被证实为具有真实生物学功能的功能元件，参与发育调控、信号传导和逆境适应。例如，拟南芥中编码36个氨基酸的POLARIS（PLS）基因参与根系生长和叶脉发育，C端编码肽（CEPs）在氮饥饿条件下作为根到地上部的长距离信号分子发挥功能。尽管sORF的生物学重要性日益凸显，但对于西瓜（Citrullus lanatus）等经济重要性极高的葫芦科作物，全基因组范围内转录活跃且逆境响应的基因间sORF目录尚未建立，这一隐藏编码层的规模及其潜在的农艺价值在很大程度上仍然未知。近期发布的西瓜97103 v3端粒到端粒（telomere-to-telomere, T2T）无缺口基因组组装，首次允许对其基因间区域进行无阻碍的系统挖掘。本研究旨在利用该参考基因组，系统鉴定和功能注释西瓜基因组中的新型基因间sORFs（novel intergenic sORFs, nsORFs），评估其翻译潜力、转录参与模式及逆境应答特征，并优先筛选具有宿主-病原互作潜能的候选序列。
**2. 主要技术方法**
研究人员基于西瓜97103 v3 T2T无缺口基因组组装，利用BEDTools提取基因间区域序列（基因区域上下游各延伸500 bp），通过EMBOSS getorf进行六框开放阅读框扫描，并采用两阶段纯化流程——DIAMOND blastx比对去除与已知蛋白相似的序列、BEDTools intersect排除重复元件重叠序列——获得非冗余nsORF目录。随后运用EMBOSS cai和cusp计算CAI和RSCU评估密码子使用特征，Infernal cmscan扫描Rfam数据库排除ncRNA重叠序列，SignalP-6.0、NLStradamus和NESmapper预测亚细胞定位信号。转录组分析方面，整合来自六个NCBI BioProject的134个RNA-seq文库，使用Salmon构建包含注释CDS和nsORF的定制转录组进行定量，DESeq2进行差异表达分析。病原互作预测采用ApoplastP和PredHPI工具，并利用FFPred4和MULocDeep进行功能注释和亚细胞定位预测。
**3. 主要研究结果**
**3.1 西瓜T2T基因组基因间区域蕴含庞大的sORF储备库**
通过对97103 v3组装中严格定义的基因间区域（≥250 Mb）进行六框扫描和两步纯化，研究人员构建了包含143,288条非冗余nsORF的全基因组目录。正反义链分布近乎对称（71,848条对71,440条），排除了系统性链偏好。染色体层面，Chr01携带最丰富的nsORF补体（17,623条），其次是Chr05（16,661条）和Chr10（14,431条），Chr04数量最少（9,021条）。由于预测器仅保留ATG起始的ORF，该目录被刻意定义为保守的下限估计。
**3.2 nsORF密码子使用特征趋近高适应性谱**
以362个核糖体相关基因（包括144个胞质40S/60S结构核糖体蛋白、117个核编码细胞器靶向核糖体蛋白、83个核糖体结构域蛋白和18个rRNA加工因子）作为参考集计算CAI，94.14%（134,887条）的nsORF达到CAI ≥ 0.7的操作阈值；其中88,614条（61.84%）CAI值为0.7–0.8，45,300条（31.62%）为0.8–0.9，973条（0.68%）CAI ≥ 0.9。阈值敏感性分析显示，随着阈值提高保留率逐步降低（CAI ≥ 0.6时为99.91%，≥0.75时为72.28%，≥0.8时为32.29%，≥0.9时为0.68%）。RSCU分析显示nsORF池中27个密码子过度代表（RSCU > 1），以AGA（2.82）、TTA（1.80）、TCT（1.71）等A/T结尾密码子偏好最为显著；核糖体参考集鉴定出28个偏好密码子，其中24个为两组共享，超几何检验极为显著（P = 7.19 × 10?1?），两个数据集的RSCU值呈显著正相关（Pearson r = 0.653），表明nsORF与宿主翻译机器在密码子使用上具有显著一致性。
**3.3 少数nsORF与已注释结构或调控RNA重叠**
Infernal cmscan扫描Rfam数据库，在134,887个高CAI nsORF中仅1,650个（1.22%）获得2,812个达到纳入阈值的匹配。按Rfam类别划分，miRNA相关家族占据主导（1,115个命中，39.65%），其次是rRNA（775个，27.56%）、未分类ncRNA（546个，19.42%）、snoRNA（246个，8.75%）、tRNA（86个，3.06%）和snRNA（33个，1.17%）。miRNA匹配中富集了具有明确发育和逆境信号调控功能的家族，包括mir-166（26个）、MIR169_2（24个）、MIR408（21个）、mir-399（19个）、MIR171_1（14个）、mir-156（13个）和mir-393（11个），提示部分nsORF位点可能构成编码层与小RNA调控层的界面。
**3.4 nsORF预测靶向架构呈现异质性**
SignalP-6.0在429个nsORF中鉴定出经典分泌信号肽（SP），NLStradamus在8,855个条目中识别出核定位信号（NLS），NESmapper在39,216个nsORF中恢复出核输出信号（NES）。三组信号的两两重叠有限（SP ∩ NLS = 5；SP ∩ NES = 176；NLS ∩ NES = 1,933），仅6个nsORF同时携带全部三类信号，构成具有复杂预测信号架构的罕见亚组，被优先推荐进行靶向实验验证。
**3.5 nsORF转录参与覆盖多种生物与非生物逆境**
134个RNA-seq文库覆盖六种逆境条件——干旱（15个文库）、弱光（12个）、根结线虫（23个）、CGMMV-硼复合处理（36个）、盐碱（24个）和白粉病（24个）。Salmon定量鉴定出18,625个nsORF（占CAI筛选池的13.8%）在至少一个文库中达到TPM ≥ 1的转录参与阈值，分布于全部11条染色体，其中Chr05（2,458个）、Chr01（2,354个）、Chr02（1,917个）领先，Chr04最少（1,073个）。组织分布呈现强烈依赖性：叶中14,473个（10.82%）、根中10,995个（8.22%）、果实中8,818个（6.59%），仅5,993个nsORF在三种组织中一致表达，表明nsORF目录的转录参与具有高度选择性。最大TPM中位数仅为6.0，呈现典型的长尾表达分布特征。
**3.6 逆境驱动的差异表达凸显nsORF作为响应元件**
30组DESeq2配对比较（FDR < 0.05；|log?FC| > 1）揭示了高度异质的响应景观。干旱胁迫下DE-sORF数量在1至6小时迅速攀升（70至223个），并在12小时（220个）和24小时（214个）维持高位，定义了时间上稳定的急性重编程窗口。弱光胁迫下基因型内比较（HY25：131个；DQ22：107个）均小于跨基因型基线（282个），表明耐受型与敏感型品种在胁迫施加前已存在显著的组成型差异。根结线虫侵染在四个时间点产生172–300个DE-sORF，D8时易感-抗性分化最为显著（300个）。盐碱胁迫下叶片组织的nsORF响应（31个）强于根组织。白粉病诱导中等程度响应（每对比2–25个），在MDR_D72h对比中达到峰值（25个）。CGMMV-硼复合处理仅产生稀疏的DE-sORF（范围0–8个）。
**3.7 五个表达的nsORF被预测与主要西瓜病原体互作**
PredHPI筛选将转录活跃的nsORF与四种西瓜相关病原体蛋白组进行交叉验证，优先确定了五个候选序列wlsORF1–wlsORF5，预测肽段长度为53–86个氨基酸，每个具有8–16个推定病原体互作伙伴。wlsORF1和wlsORF4分别与来自瓜类细菌性果斑病菌（Acidovorax citrulli）和软腐病菌（Pectobacterium spp.）的16个蛋白互作；wlsORF3和wlsORF5分别与炭疽病菌（Colletotrichum orbiculare）和白粉病菌相关的13个和9个预测伙伴关联；wlsORF2与白粉病菌的8个预测伙伴关联。病原体侧互作对应物富集于线粒体细胞色素c亚基（COX1、CYC1）、内膜转位子组分（TIM23、CCMFN2）、DegP类蛋白酶DEGP1和光系统I核心PSAA，提示预测互作涉及膜相关和电子传递蛋白。
**3.8 五个HPI优先nsORF的预测膜相关及功能特征**
FFPred4分析显示五个候选序列共享膜相关预测特征，四个候选的"膜整合组分"（GO:0016021）和"膜内在组分"（GO:0031224）得分≥0.99。功能注释呈现异质性：wlsORF1关联激酶活性（GO:0016301，0.984）和线粒体膜相关注释（GO:0031966，0.848）；wlsORF2主要关联ATP结合（GO:0005524，0.960）；wlsORF3显示离子跨膜运输（GO:0034220，0.982）、钾离子转运蛋白活性（GO:0015079，0.938）和阳离子通道活性（GO:0005261，0.930）；wlsORF4同时关联跨膜运输（GO:0055085，0.986）和序列特异性DNA结合转录因子活性（GO:0003700，0.931）；wlsORF5接受细胞因子活性（GO:0005125，0.853）和质膜定位（GO:0005886，0.821）预测。MULocDeep预测wlsORF1、wlsORF2、wlsORF3和wlsORF5定位于内质网，wlsORF4定位于线粒体内膜，与FFPred4的膜相关注释总体一致。
**4. 讨论与结论**
本研究利用西瓜T2T无缺口基因组组装，系统鉴定了143,288个基因间nsORF，规模显著超过拟南芥的7,159个编码潜能sORF，与黄瓜（420,723个）和番茄（676,611个）的近期研究处于同一数量级，反映了T2T组装在揭示基因贫乏、转座子富集区域方面的优势。CAI分析和RSCU一致性为nsORF与宿主翻译机器的相容性提供了序列层面的支持，但CAI ≥ 0.7本身并不构成翻译的直接证据。Rfam重叠分析将1.22%的高CAI nsORF定位为编码-非编码界面，其中miRNA相关匹配集中于发育和逆境调控家族，支持miPEP假说或位置重叠假说的可能性。运输信号预测揭示了NES ? NLS ? SP的异质性架构，但不同预测器的训练集差异要求谨慎解读。多逆境转录组分析确立了18,625个转录参与的nsORF，其表达呈现组织、基因型和逆境特异性重编程模式，而非弥漫的背景活性。五个PredHPI优先候选序列（wlsORF1–wlsORF5）具有预测的膜相关特征和多样化的推定功能注释，但其物理互作及参与抗病性的功能均未经实验验证。研究结论指出，本研究提供了T2T锚定的西瓜nsORF资源及整合序列组成、ncRNA排除、转录参与、逆境响应和预测宿主-病原互作的分层分析框架，但应视为候选序列的优先排序框架而非肽段产生或生物学活性的直接证据。未来需要整合Ribo-seq、小肽优化蛋白质组学、非ATG起始模型、亚细胞定位实验、互作验证和植物体内功能分析，以确定哪些候选序列代表真正的翻译微肽，并阐明其是否有助于西瓜的逆境适应和抗病性。
