《Scientia Horticulturae》：The miR156-SPL9-ARR2 module promotes zeatin signal and increases the fruit shape index in persimmon
编辑推荐：
柿（Diospyros kaki Thunb.）的长形与扁形果实群体在果实形状指数（FSI，纵径与横径之比）上表现出丰富变异，但其分子调控机制尚不清楚。研究人员在S2（5月28日）、S3（6月14日）和S5（7月3日）三个发育阶段对长形与扁形群体进行比较细胞学
柿（Diospyros kaki Thunb.）的长形与扁形果实群体在果实形状指数（FSI，纵径与横径之比）上表现出丰富变异，但其分子调控机制尚不清楚。研究人员在S2（5月28日）、S3（6月14日）和S5（7月3日）三个发育阶段对长形与扁形群体进行比较细胞学观察、mRNA与microRNA（miRNA）转录组分析，确定这些阶段为FSI形成的关键期。果实形状变异由细胞数目与细胞体积共同驱动，其中细胞数目主导纵向伸长，细胞体积主导横向扩张。加权基因共表达网络分析（WGCNA）显示两个模块在S3和S5与FSI正相关的（p＝0.05）。枢纽基因中包含转录因子ABI8与MYB98，以及可能编码细胞分裂素响应蛋白的ARR2。研究人员鉴定出5个促长形miRNA-mRNA调控元和17个抑长形调控元；miR156-SPL为抑长形调控元，长形果中miR156成员水平高而靶基因SPL9水平低，提示SPL对ARR基因的抑制被解除，细胞分裂素（CTKs）信号增强从而提高FSI。外源玉米素（zeatin，ZT）处理使扁形柿FSI升高，在一定程度上验证了该假设。该研究部分阐明了柿果实形状的分子基础，可为柿果实形状分子育种提供指导。
研究背景方面，柿（Diospyros kaki Thunb.）为柿树科柿属重要木本果树，中国栽培历史最长且种植面积最大。多数栽培品种为六倍体，果实形状多样，纵径、横径、果形指数等形态性状变异明显。扁果因果顶凹陷可导致‘Jiro’裂果、‘Gongcheng Yueshi’去皮困难，理想果形需兼顾加工适应性与外观品质。已有研究提示KNAT1、CNR1、ANT及生长素（IAA）、赤霉素（GA）、玉米素（ZT）、油菜素内酯（BRs）、脱落酸（ABA）等参与果形调控，但柿果实形状指数（FSI）形成的分子机制仍不清楚。因此，研究人员以长形组与扁形组为材料，在已定位的S2、S3、S5关键阶段开展细胞学、转录组与miRNA整合分析，以揭示FSI调控网络。
主要技术方法方面，研究人员从260份种质中选取8个长形与9个扁形柿品种，细胞学分析用4个品种，转录组与small RNA分析用17个品种，于S2、S3、S5采样；样品来自中国林业科学研究院经济林研究开发中心柿种质资源圃。细胞学采用扫描电镜观察固定样品；转录组用HISAT2比对柿参考基因组，edgeR做差异表达；WGCNA构建共表达模块并以Cytoscape/cytoHubba筛选枢纽基因；small RNA测序鉴定miRNA及其靶基因；以扁形品种‘Ohiratane’做外源玉米素（ZT）1、5、10 mg/L喷施处理并测果实形态；表达验证采用RT-qPCR与2-ΔCt、2-ΔΔCt方法，统计用ANOVA与Tukey HSD。
3.1 Persimmon FSI co-determined by cell number and volume：研究人员对横轴与纵轴细胞面积和数目进行量化，发现扁形果横轴细胞面积较大，长形果纵轴细胞数目更多；结果表明FSI由细胞数目与细胞体积共同决定，纵向伸长主要由细胞数目驱动，横向扩张主要由细胞体积驱动。
3.2 Transcriptome sequencing and gene expression analysis：研究人员对长形组与扁形组51个样品测序，低中表达转录本占多数；PCA与聚类按果形和阶段分开。差异表达基因（DEGs）数目随发育推进增加，7月最多，长形组与扁形组共有99个DEGs，说明转录谱具有阶段特异性和形状依赖性。
3.3 Identification of genes related to FSI in persimmon：GO与KEGG富集显示，5月上调基因关联rRNA加工，6月上调基因关联肽酶与水解酶，7月上调基因关联DNA复制与代谢，7月下调基因关联磷酸中继信号转导与转录因子活性；KEGG中7月下调基因富集植物激素信号转导（sly04075），提示激素通路参与FSI形成。
3.4 WGCNA co-expression module construction and association analysis：研究人员以表达量大于5 FPKM基因建网，6月软阈值5得到28个模块，MEturquoise模块与FSI正相关（r＝0.48，P＝0.05），含4051个基因，富集DNA复制；枢纽基因有ABI3、MYB98与ARR2，且在长形组中高表达。7月软阈值4得到25个模块，MEturquoise（r＝0.53，P＝0.03）与MEgrey（r＝0.48，P＝0.05）与FSI正相关；MEturquoise含7093个基因，枢纽基因含乙烯响应因子ERF016，其在长形组高表达。RT-qPCR验证10个DEGs趋势与RNA-seq一致。
3.5 Differential gene expression in hormone pathways and response to exogenous hormone treatment：研究人员将DEGs与ZT、GA、IAA通路比对，发现玉米素合成基因CYP735A在长形果中5月至7月渐升、扁形果中下降；GA通路ZHD1与FUS3在长形果上调；IAA相关YUC8、RGLG2等两组趋势相近。外源ZT处理‘Ohiratane’后，10 mg/L处理显著提高纵径、横径、侧径、FSI与单果鲜重，证实细胞分裂素（CTKs）信号参与柿FSI调控。
3.6 Key miRNA-target modules associated with persimmon FSI：small RNA测序鉴定264个miRNA；长形组中miR156a、miR156d-5p及其靶基因SPL9、RPL22B、MAP70.5等呈现miRNA高、靶基因低或相反模式。保守miR156-SPL模块被确定为关键调控模块；长形果miR156高抑制SPL9，解除SPL9对ARR2的抑制，增强CTKs信号并促进纵向伸长。
讨论部分总结：研究人员指出果形由遗传、激素与环境共同影响，本研究统一田间管理以突出遗传与激素因素。细胞数目与体积的方向性差异说明激素网络精确调控果形；CTKs促进纵向生长在黄瓜CYP735A、梨、苹果、葡萄ARR1等研究中也有呼应。GA通路ZHD1、FUS3及IAA相关YUC在其它物种中同样关联伸长或纵向分裂。miR156-SPL为保守模块，可整合GA与CTKs信号；本研究提出长形果中高miR156抑制SPL9，缓解其对ARR2的抑制，从而增强玉米素信号。ABI3、MYB98可能与CTKs通路平行作用，未来需时空表达、蛋白互作与靶向突变解析层级关系。
结论部分翻译：本研究综合细胞学、转录组与激素机制分析柿果形变异。通过对长形组与扁形组三个关键发育阶段比较细胞观察，证明FSI由细胞数目与细胞面积共同决定，纵向伸长主要由细胞数目增加驱动，横向扩张主要由细胞面积增加驱动。转录组分析揭示阶段特异与形状依赖表达；WGCNA鉴定出与FSI关联的模块及枢纽基因ABI8、MYB98与ARR2；激素通路分析显示细胞分裂素（CTKs）与赤霉素（GA）促进纵向生长，长形组中CYP735A1、ZHD1与FUS3上调。miRNA-mRNA网络尤其是保守miR156-SPL9模块是关键转录后调控元：长形组中miR156升高抑制SPL9，缓解SPL9对CTKs响应基因ARR2的抑制并增强CTKs信号，从而促进纵向伸长；外源ZT处理显著提高FSI。综上，研究通过细胞、激素与分子证据阐明柿果形形成整合框架，为柿果形分子育种提供候选基因与miRNA-靶模块。该论文发表在《Scientia Horticulturae》。
