苹果酸酶1（ME1）感知L-乳酸以决定肿瘤异质性

《Signal Transduction and Targeted Therapy》：Malic enzyme 1 senses L-lactate to determine tumor heterogeneity

　　

L-乳酸通常在肿瘤中升高，并作为一种信号分子促进肿瘤进展。在此，研究人员揭示苹果酸酶1（ME1）通过直接结合精氨酸155（R155）而充当一种先前未被识别的L-乳酸传感器，从而增强恶性程度。机制上，L-乳酸结合通过减少赖氨酸362（K362）乙酰化促进ME1的核转位，该过程由核转运蛋白-α 4（KPNA4）的核输入所介导。ME1的核积累增强了转移潜能，这与增加与肝癌衍生生长因子（HDGF）的相互作用以及获得上皮间质转化（EMT）相关表型相关联。在营养缺乏条件下，L-乳酸促进ME1-乳酸脱氢酶B（LDHB）复合物的组装，这增强了氧化磷酸化（OXPHOS）并增加了ATP产生，表明一种支持肿瘤细胞存活的代谢适应机制。值得注意的是，破坏L-乳酸结合的ME1R155A突变体在体内消除了L-乳酸-ME1轴对肿瘤进展的促肿瘤效应。总之，这些发现将ME1鉴定为L-乳酸的直接传感器，并支持一个模型，在该模型中，乳酸介导的信号传导和代谢适应汇聚于ME1，以在异质性代谢条件下以环境依赖性方式调控肿瘤细胞可塑性。这些见解增进了对癌症中代谢适应的时空控制的理解，并揭示了一个潜在的治疗靶点。

肿瘤代谢异质性与L-乳酸传感机制的研究解读

研究背景

肿瘤异质性对有效癌症治疗构成了根本性挑战，尤其在前列腺癌、肺癌和结直肠癌等常见实体恶性肿瘤中，这些肿瘤表现出显著的细胞多样性，削弱了化疗、靶向治疗和免疫治疗等常规疗法的效果。尽管形态学和遗传学多样性长期以来被认为是肿瘤疾病的标志，但越来越多的证据表明，代谢异质性构成了肿瘤复杂性的同等关键维度。代谢重编程最近成为肿瘤进展的一个关键但被低估的驱动因素，它使癌细胞能够动态适应不同的微环境条件，从而赋予竞争性生长优势并驱动治疗耐药性。在代谢异质性的各种表现中，乳酸的积累及其空间异质性分布尤为重要。乳酸作为糖酵解代谢的终产物，在特定肿瘤区域的组织浓度平均超过15 μmol/g，局部峰值甚至超过40 μmol/g。超越其传统上作为代谢废物的概念，乳酸已成为一种具有多效生物学功能的关键信号分子。然而，能够将代谢信号转导为特定信号级联反应的直接细胞内乳酸传感器的种类仍然非常有限，这在理解肿瘤细胞如何解码乳酸丰度以执行适应性程序方面留下了关键空白。

苹果酸酶1（ME1）在细胞代谢中占据中心节点，可能桥接生物能量适应与信号转导。这种胞质酶催化苹果酸氧化脱羧生成丙酮酸，同时伴随NADP⁺还原为NADPH。近期研究表明ME1是一种促癌因子，且翻译后修饰，特别是可逆乙酰化，关键地调控ME1的酶活性和蛋白质稳定性，暗示ME1功能可能受代谢微环境信号的动态调节。基于此，本研究旨在探究ME1是否可作为L-乳酸的直接传感器，以及该传感机制如何在肿瘤异质性条件下调控肿瘤细胞的命运决定。

研究方法概述

该研究综合运用了多种关键技术方法。首先，通过构建前列腺特异性Pten敲除小鼠模型并进行靶向代谢组学分析，鉴定了乳酸在前列腺癌组织中的富集。其次，利用蛋白质晶体学解析了人源ME1与NADP⁺、Mn²⁺以及L-乳酸的三维复合物结构，并通过等温滴定量热法（ITC）和生物素-乳酸下拉实验验证了直接结合。第三，采用基因编辑技术（CRISPR/Cas9）构建了Me1条件性敲除小鼠品系，并与Pten缺失小鼠杂交以评估ME1在体内的功能。第四，通过免疫共沉淀联合质谱（IP-MS）筛选并鉴定了ME1的相互作用蛋白，包括KPNA4、SIRT5、HDGF和LDHB。第五，利用同位素示踪技术（¹³C标记的苹果酸和乳酸）追踪代谢通量变化，并结合海马生物能量分析仪评估线粒体功能。此外，还使用了临床肿瘤组织芯片（TMA）和TCGA数据库进行相关性分析。

研究结果

L-乳酸增加ME1表达水平，且前列腺特异性敲除Me1抑制Pten缺陷小鼠的肿瘤进展

在Pten缺失的前列腺癌小鼠模型中，靶向代谢组学分析显示前列腺组织中乳酸水平显著升高，其中L-乳酸浓度约为20 μmol/g。体外实验表明，在营养缺乏培养基中，L-乳酸以剂量和时间依赖的方式上调ME1的表达，且该效应具有立体异构体特异性（仅L-乳酸而非D-乳酸）。临床组织芯片分析显示，ME1在前列腺癌组织中表达显著高于癌旁正常组织，且TCGA数据表明高ME1表达患者生存率更低。通过构建前列腺特异性Me1敲除小鼠并进一步与Pten敲除小鼠杂交，研究发现Me1缺失显著降低了前列腺重量、延缓了前列腺上皮内瘤变（PIN）病变进展、减轻了平滑肌鞘的破坏，并显著延长了小鼠的生存期。

L-乳酸通过直接结合被ME1感知

研究人员解析了人源ME1与NADP⁺、Mn²⁺以及L-乳酸的三维晶体结构，分辨率分别达到2.31 ?和2.03 ?。结构显示L-乳酸结合在ME1的活性位点，其O1与Arg155（R155）侧链形成氢键，Mn²⁺稳定了这一相互作用。ITC测定表明L-乳酸与ME1的结合亲和力为毫摩尔级别（Kd = 1.98 ± 0.64 mM），而天然底物苹果酸的亲和力为微摩尔级别（Kd = 2.41 ± 0.16 μM）。然而，在缺氧条件下，乳酸的大量积累使其在与苹果酸的竞争中占据优势。R155A突变体完全破坏了L-乳酸结合。有趣的是，虽然L-乳酸抑制了纯化重组ME1的酶活性，但在完整细胞中，ME1^R155A突变并未显著改变苹果酸到丙酮酸的代谢通量，提示细胞内存在代谢缓冲或补偿机制。

L-乳酸诱导K362去乙酰化并增强ME1核转位

免疫荧光分析显示，Pten敲除小鼠前列腺癌组织中，核内Me1分布增强的细胞增殖标志物Ki-67表达较低。L-乳酸处理促进了ME1从胞质向核内的转位，而ME1^R155A突变则消除了这一效应。通过筛选核转运蛋白家族成员，研究人员发现只有KPNA4能与ME1结合，且L-乳酸增强了这种相互作用，而ME1^R155A则抑制了该效应。机制上，L-乳酸通过结合ME1的R155位点，促进了去乙酰化酶SIRT5与ME1的相互作用，导致ME1第362位赖氨酸（K362）去乙酰化。模拟乙酰化的K362Q突变阻断了L-乳酸诱导的ME1核转位。使用单羧酸转运蛋白1（MCT1）抑制剂AZD3965提高细胞内乳酸水平同样获得了相似的结果。

L-乳酸促进的核转位增强了肿瘤转移

通过构建表达野生型ME1、融合核定位信号（NLS）的ME1或融合核输出信号（NES）的ME1的细胞系，研究人员发现ME1核转位并不影响细胞增殖，但显著调控了上皮间质转化（EMT）标志物的表达：核定位的ME1降低E-钙黏蛋白（E-cadherin）表达并增加波形蛋白（vimentin）表达。IP-MS筛选发现肝癌衍生生长因子（HDGF）是核内ME1的新结合伙伴，且L-乳酸增强了二者的相互作用。HDGF与L-乳酸协同激活Smad2/3信号通路，该效应依赖于ME1的存在。在小鼠异种移植模型中，L-乳酸虽抑制了皮下肿瘤的生长，却显著促进了肺转移灶的形成和面积增大，而阻断ME1核转位（表达ME1^NES）则减弱了L-乳酸的促转移作用。

L-乳酸通过在营养缺乏条件下增强与LDHB的相互作用促进细胞存活

在营养缺乏培养基中，L-乳酸促进了表达野生型ME1的肿瘤细胞存活，但对表达ME1^R155A的细胞无此效应。IP-MS筛选发现，在营养缺乏条件下，L-乳酸特异性增强了ME1与LDHB的相互作用，但不增强与LDHA的相互作用，而ME1^R155A突变阻断了这一增强效应。体外酶活分析显示ME1可上调LDHB的酶活性。海马分析表明，L-乳酸增强的耗氧率（OCR）依赖于ME1和LDHB。同位素示踪证实，来自L-乳酸的¹³C碳原子直接进入了三羧酸循环（TCA cycle）中间代谢物，并提高了NAD⁺/NADH比值，进而增加ATP产生。ME1^R155A突变消除了L-乳酸对线粒体功能的刺激作用。

ME1^R155A突变在体内阻碍了L-乳酸对肿瘤进展的有利效应

在异种移植小鼠模型中，静脉注射L-乳酸抑制了表达野生型ME1肿瘤的生长，但该抑制效应在ME1^R155A组中被消除。更重要的是，L-乳酸显著促进了ME1^WT组的肺转移，而ME1^R155A突变组的肺转移比率和病灶面积均显著降低。免疫荧光共定位分析显示，L-乳酸处理增强了ME1^WT肿瘤组织中ME1与LDHB的共定位，而在ME1^R155A组中无此现象。使用MCT1抑制剂AZD3965提高细胞内乳酸水平也获得了相似的结果：AZD3965抑制了ME1^WT肿瘤生长并增加了转移灶面积，但对ME1^R155A肿瘤无显著影响。

讨论与结论

本研究的结论表明，ME1是一种直接的L-乳酸细胞内传感器，其功能取决于营养可用性，充当分子开关来决定肿瘤细胞的替代命运。在营养充足条件下，L-乳酸结合ME1启动信号级联反应，通过SIRT5介导的K362去乙酰化和KPNA4依赖的核输入促进ME1核转位，核内ME1与HDGF相互作用激活EMT转录程序，最终增强转移能力。在营养缺乏条件下，L-乳酸-ME1轴转向代谢适应模式，通过促进ME1与LDHB复合物的组装，增强LDHB活性，促进乳酸衍生的碳进入TCA循环，提高NAD⁺/NADH比值和OXPHOS，从而维持ATP产生和细胞存活。ME1^R155A突变体通过阻断L-乳酸结合，在体内外均消除了上述促肿瘤效应。该研究揭示了L-乳酸-ME1轴作为一个保守的代谢感应机制，在不同上皮恶性肿瘤中介导肿瘤适应，并提出了一个潜在的泛癌治疗靶点，为开发针对该相互作用的小分子干扰剂以克服治疗耐药性提供了理论基础。