《Scientific Reports》：TFAP2B and FOXC1 are associated with biologically and clinically distinct differentiation states in triple-negative breast cancer
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摘要
三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer, TNBC）包含生物学上不同的亚型，包括管腔雄激素受体（luminal androgen receptor, LAR）肿瘤，但常规免疫组织化学标志物并不能完全反映谱系相关的分化状态
摘要
三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer, TNBC）包含生物学上不同的亚型，包括管腔雄激素受体（luminal androgen receptor, LAR）肿瘤，但常规免疫组织化学标志物并不能完全反映谱系相关的分化状态。研究人员研究了与上皮分化相关的AP-2家族转录因子TFAP2B，以及与基底样表型相关的转录因子FOXC1，作为TNBC中管腔和基底分化的互补标志物。在包含105例TNBC的组织微阵列中，根据标志物的相对优势将肿瘤分为TFAP2B优势型、FOXC1优势型或双阴性型，并利用谱系、增殖、分子、免疫和化疗反应参数对其进行表征。TFAP2B优势型肿瘤与一致的管腔表型相关，包括顶泌/小叶形态富集、MUCL1和AR强表达、CK18高表达、SOX10低表达、增殖减少、频繁的野生型p53模式、RB1表达保留以及PD-L1低表达。FOXC1优势型肿瘤则显示出相反的基底样特征。这些关联在METABRIC TNBC队列的转录组和基因组水平上得到了独立支持。FOXC1优势型肿瘤还比TFAP2B优势型肿瘤更频繁地出现化疗诱导的降期。综上，研究人员将TFAP2B确定为与TNBC中管腔分化相关的标志物，并支持将TFAP2B/FOXC1联合评估作为识别临床相关TNBC分化状态的实用框架。
论文解读
一、研究背景与问题
三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer, TNBC）约占所有乳腺癌病例的10%–15%，其定义为雌激素受体（estrogen receptor, ER）、孕激素受体（progesterone receptor, PR）和人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2, HER2）表达均缺失。TNBC是一种分子高度异质的肿瘤实体，具有侵袭性临床行为和不良预后，给诊断分类和治疗决策带来困难。基于基因表达谱，Lehmann等人将TNBC划分为多个分子亚型，包括基底样1型（basal-like 1, BL1）、基底样2型（basal-like 2, BL2）、间质型（mesenchymal, M）和管腔雄激素受体型（luminal androgen receptor, LAR）。尽管世界卫生组织（WHO）乳腺肿瘤分类已承认这些亚型，但目前尚无可靠的常规检测方法用于亚型鉴定。免疫组织化学（immunohistochemistry, IHC）可能成为临床实施的实用且广泛适用的替代方案。
在TNBC亚型中，LAR约占15%，具有管腔样表达谱、ER通路激活的分子证据、雄激素受体（androgen receptor, AR）强表达，并与顶泌或小叶形态密切相关。临床上，LAR肿瘤多见于老年患者，增殖率较低、组织学分级较低，但对新辅助化疗反应差，病理完全缓解率低。目前AR是LAR亚型唯一的既定IHC标志物，但其诊断准确性有限，多种基于AR的标志物组合特异性仍不足。MUCL1（小乳腺上皮黏蛋白，small breast epithelial mucin, SBEM）在正常乳腺上皮和乳腺癌中表达高度受限，研究人员前期发现MUCL1与LAR亚型相关，且其mRNA表达与转录因子TFAP2B强相关。TFAP2B（AP-2β）属于AP-2转录因子家族，具有激活和抑制作用，在乳腺癌中与AR表达、低Ki-67指数、较低肿瘤分级、小叶形态和管腔分化相关，但在TNBC包括LAR亚型中的作用尚未充分探索。与之相对，FOXC1属于叉头框（forkhead box, FOX）转录因子家族，与基底样表型相关，在TNBC中与化疗敏感性相关，并与AR表达呈负相关。基于此，研究人员假设TFAP2B和FOXC1分别标记TNBC中相反的管腔和基底分化状态，并探讨联合IHC评估能否识别超越传统AR分类和MUCL1单独表达的生物学一致的TNBC亚组。
二、研究设计与方法
本研究纳入105例女性TNBC患者，组织学亚型包括顶泌癌（n=6）、小叶癌（n=6）、髓样癌（n=8）、化生性癌（n=11）和非特殊类型浸润性癌（n=74）。所有患者均在德国慕尼黑工业大学右岸医院（Klinikum rechts der Isar, Technical University of Munich, TUM）乳腺中心接受根治性手术。构建组织微阵列（tissue microarray, TMA），每个样本取2mm直径核心，三倍重复。免疫组织化学染色采用自动化染色系统，对TFAP2B、FOXC1、MUCL1、GCDFP-15、SOX10、GATA3、TRPS1等标志物采用乘积评分（强度×阳性细胞百分比），对AR和FOXA1采用H-score评估。根据TFAP2B和FOXC1的相对表达优势，将肿瘤分为TFAP2B优势型、FOXC1优势型和双阴性型。化疗反应通过比较新辅助治疗前临床/影像学肿瘤分期（cT/iT）与治疗后病理分期（ypT）评估，分为降期、稳定和进展。统计分析使用R软件（版本4.4.1），包括卡方检验、Fisher精确检验、Wilcoxon秩和检验、Kruskal-Wallis检验、Firth逻辑回归，以及Benjamini-Hochberg多重检验校正。外部验证采用METABRIC队列的TNBC转录组和基因组数据，计算FOXC1-TFAP2B对齐评分（z(FOXC1)-z(TFAP2B)）进行分析。
三、主要研究结果
1. 联合TFAP2B/FOXC1分层揭示TNBC中不同的临床病理学特征
免疫组化分析显示TFAP2B和FOXC1呈异质性核表达。在105例肿瘤中，17例仅表达TFAP2B，60例仅表达FOXC1，20例同时表达两者。基于优势分类后，FOXC1优势型肿瘤多见于年轻患者和T1期，而TFAP2B优势型肿瘤更多与晚期原发肿瘤相关。组织学分级差异显著，高级别癌（G3）在FOXC1优势型中占主导，而TFAP2B优势型富集低-中级别形态。增殖活性沿TFAP2B/FOXC1轴呈明显梯度：Ki-67在TFAP2B优势型中最低、FOXC1优势型中最高，AURKA表达分布相似。多变量Firth逻辑回归证实较低组织学分级、较高病理T分期和较低Ki-67与TFAP2B优势独立相关。
2. TFAP2B/FOXC1亚组定义组织学分布和LAR相关标志物表达
TFAP2B/FOXC1表达模式在不同组织学亚型中差异显著。顶泌癌强烈富集TFAP2B优势型（83.3%），小叶癌也以TFAP2B优势型（66.7%）或双阴性（33.3%）为特征，而髓样癌和化生性癌分别有87.5%和81.8%为FOXC1优势型。LAR相关标志物方面，MUCL1表达与TFAP2B/FOXC1状态高度相关（p=3.0×10?1?），TFAP2B优势型中63.6%显示高水平MUCL1（评分≥6），而FOXC1优势型中93.3%完全阴性。AR表达模式相似（p=2.2×10?12），TFAP2B优势型中位H-score为135，FOXC1优势型为0。GCDFP-15和FOXA1也呈现相同趋势。
3. 基底和管腔谱系标志物在TFAP2B/FOXC1亚组中的表达
细胞角蛋白18（CK18）强度与TFAP2B/FOXC1状态强相关（p=1.19×10??），TFAP2B优势型中86.4%显示高强度CK18（评分3），而FOXC1优势型中90.6%为弱至中度染色。SOX10表达也显著不同（p=4.21×10??），TFAP2B优势型中95.5%为阴性，而FOXC1优势型中68.0%显示高评分（≥6）。GATA3和TRPS1联合分析显示，TFAP2B优势型富集GATA3阳性表型（59.1%），FOXC1优势型以GATA3阴性/TRPS1阳性为主（69.3%）。
4. FOXC1相关的p53状态、免疫标志物和c-MET表达差异
p53表达模式在各组间显著不同（p=5.40×10?3），TFAP2B优势型最常见野生型p53模式（59.1%），FOXC1优势型富集异常p53表达（过表达46.7%，缺失型28.0%）。RB1表达差异显著（p=2.62×10?2），TFAP2B优势型中77.3%显示强RB1表达（评分3），FOXC1优势型中24.0%完全缺失RB1。PD-L1免疫细胞（IC）阳性率在FOXC1优势型中更高（40.5%≥1%），而TFAP2B优势型中81.8%为PD-L1阴性。c-MET表达在FOXC1优势型中显著升高（中位H-score 174），高于TFAP2B优势型（中位100）。
5. 按TFAP2B/FOXC1状态分层的化疗反应
化疗反应在TFAP2B/FOXC1亚组间差异显著（p=0.0024）。TFAP2B优势型肿瘤降期率仅16.7%，进展率16.7%；而FOXC1优势型肿瘤降期率高达66.7%，进展率仅4.8%。多变量Firth逻辑回归在校正治疗前T分期后显示，TFAP2B优势型肿瘤降期可能性显著低于FOXC1优势型（OR=0.14, 95% CI 0.02–0.58, p=0.006），额外校正Ki-67或组织学分级后关联仍稳健。
6. METABRIC队列中的转录和基因组验证
在METABRIC TNBC队列（n=320）中，TFAP2B和FOXC1表达呈负相关（Spearman ρ=?0.37, p<0.001）。FOXC1-TFAP2B对齐评分与较年轻诊断年龄、导管/NST组织学、高级别肿瘤相关。TFAP2B与MUCL1、AR、PIP/GCDFP-15、FOXA1等管腔相关标志物强正相关（ρ=0.58–0.66），FOXC1则与这些标志物负相关。FOXC1与SOX10和MKI67正相关，TFAP2B与之负相关。递增的对齐评分与TP53突变（OR=1.22/单位评分）和RB1缺失（OR=1.19/单位评分）概率增加相关。
四、讨论与结论
本研究表明，FOXC1和TFAP2B在TNBC中与相反但非互斥的基底和管腔分化状态相关，伴随不同的分子、免疫表型和临床特征。FOXC1优势型肿瘤重现基底样特征：高增殖、高分级、SOX10阳性、PD-L1富集、c-MET高表达、频繁异常p53和RB1缺失，且新辅助化疗降期率高。TFAP2B优势型肿瘤则呈现连贯的管腔表型：低增殖、低分级、AR/MUCL1/GCDFP-15/FOXA1表达、CK18高表达、SOX10阴性、野生型p53和RB1保留、PD-L1低表达，对化疗反应差。这些关联在METABRIC队列中得到独立验证，增强了结果的稳健性。
研究结论指出，TFAP2B是Tnbc中与管腔分化相关的标志物，联合TFAP2B/FOXC1评估可作为一种实用的免疫组织化学框架，用于识别跨越管腔和基底分化谱系的临床相关TNBC肿瘤表型。这一框架可能有助于改善TNBC的亚型识别，并为治疗决策特别是化疗敏感性预测提供参考。研究的局限性包括回顾性单中心设计、部分亚组样本量小、未进行功能实验，以及化疗反应评估采用降期而非病理完全缓解（pCR）或残余肿瘤负荷（RCB），因此治疗反应分析应视为探索性，预后分析需在独立的前治疗活检队列中验证。
