《Gels》：Multifunctional Agarose-Based Biomaterials: From Tissue Engineering and Immunomodulation to Advanced Diagnostics and Translational Applications
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琼脂糖是一种从红藻中提取的天然海洋多糖，已从传统的电泳基质发展为用于生物医学工程的多功能生物材料平台。其热可逆凝胶化、可调的孔结构、光学透明性、在测试条件下通常较低的免疫原性以及化学可修饰性，使其能够应用于组织工程、药物递送、分子诊断、免疫调节和细胞保存。本综
琼脂糖是一种从红藻中提取的天然海洋多糖，已从传统的电泳基质发展为用于生物医学工程的多功能生物材料平台。其热可逆凝胶化、可调的孔结构、光学透明性、在测试条件下通常较低的免疫原性以及化学可修饰性，使其能够应用于组织工程、药物递送、分子诊断、免疫调节和细胞保存。本综述批判性地审视了基于琼脂糖的生物材料的最新进展，重点关注结构–性能关系、刺激响应递送系统、再生支架、免疫–材料相互作用、琼脂糖赋能诊断微器件以及无二甲基亚砜（DMSO）低温保存。代表性进展包括：在加标血浆中对循环游离DNA（cfDNA）替代物和组蛋白进行概念验证性微流控检测；用于控制释放和骨软骨修复的琼脂糖复合水凝胶；用于巨噬细胞调节研究的含琼脂糖复合水凝胶；以及琼脂糖/海藻糖系统，在所报道的细胞模型中，其解冻后即刻存活率与传统DMSO-based保存相当，但解冻后增殖仍较低。琼脂糖在电泳和生物分离领域已实现商业化，而治疗性递送和可植入再生系统仍主要处于临床前阶段。剩余障碍包括：体内降解性有限、内在细胞黏附性和生物活性不足、机械强度与可注射性和可打印性之间的权衡，以及制造和监管标准化不完善。未来工作应优先考虑明确的降解途径、可重现的组成–性能关系、应用特定基准测试以及临床相关验证。
1. 引言
组织工程将细胞、生物材料支架和指导性微环境相结合，其形式从薄膜到三维构建体不等。天然和合成聚合物为这一目的提供了可调平台，其中碳水化合物衍生聚合物因其结构多样性、普遍良好的生物相容性和化学功能化潜力而受到重视。琼脂糖作为重要的海洋多糖平台，具有独特的热可逆凝胶特性，可制备成块状或可注射水凝胶、自修复黏附系统、纤维和三维打印支架，并已被研究用于控制递送、软骨和骨修复、创面修复、诊断平台以及低温保存。近年来的综述从不同角度讨论了基于琼脂糖的生物材料，但尚缺乏对其在免疫调节、生物传感、分子诊断、低温保存和智能生物制造等领域新兴应用的系统讨论，也缺乏对结构–性能–功能关系的整合分析，以及对其临床转化潜力的充分关注。本综述旨在提供全面的批判性概述，涵盖琼脂糖的结构特征、流变学性质、改性策略和新兴生物医学应用，并特别关注免疫调节、组织修复、诊断、低温保存和转化医学的最新进展。此外，还批判性讨论了当前临床状态、监管考量、转化障碍和未来前景。
2. 琼脂糖化学与性质
琼脂糖凝胶化通常分为三个阶段：诱导、凝胶化和准平衡。冷却时，琼脂糖链经历螺旋转变，随后螺旋域聚集形成交联区，氢键介导的物理结合是网络形成的核心。与通常需要化学交联的多糖不同，琼脂糖无需共价交联剂即可通过物理凝胶化形成网络。琼脂糖凝胶是由非离子多糖在水溶液中形成的弹性、浑浊材料，琼脂糖分子形成的纤维状胶束充当结晶交联区，通过聚合物链相互连接构建三维网络。该网络能够稳定保留水分并维持特定形态，其弹性源于连接结晶交联区的琼脂糖分子链的熵弹性。其三维网络结构类似于细胞外基质，为生物学相关研究提供了模拟微环境。这些性质支持了从电泳、亲和色谱、细胞包封、诊断生物传感器、控制药物递送到类器官和微生理平台等多种应用。
3. 琼脂糖在生物医学中的应用
3.1. 核酸和蛋白质的分离与检测
疾病诊断、治疗反应评估和预后越来越依赖蛋白质和核酸标志物的联合检测。由于异质性疾病并非总能被单一标志物捕获，多重和多模态检测是体外诊断和即时检测的重要方向。通过改变琼脂糖浓度和加工条件，可调控孔径以实现生物分子分离；琼脂糖还提供光学兼容的多孔基质，适用于荧光和比色读出，并可与电泳和传感平台集成。脓毒症是涉及全身和微循环功能障碍的致命综合征，循环游离DNA和组蛋白正被研究作为宿主损伤、严重程度和预后的补充生物标志物。Shahriari和Selvaganapathy开发了一种琼脂糖门控微流控装置，用于同时荧光检测150 bp DNA片段（作为cfDNA替代物）和血浆中的组蛋白。脱水琼脂糖门含有固定化染料，上样时再水化，可在20分钟内使用30 μL血浆实现片上染色和空间分离。该测定使用加标血浆样本进行评价，未测试临床患者样本。与LC–MS/MS组蛋白分析相比，该装置具有更快的工作流程、更小的样本需求和更简单的仪器，但无法区分单个组蛋白种类，且仅基于加标样本，因此应视为分析概念验证而非临床验证的诊断平台。
3.2. 控制药物释放与递送
与离子型多糖不同，琼脂糖形成不依赖盐、热可逆的物理网络。其孔结构和扩散行为可通过浓度、热历史和配方调整，但固有的生物活性有限，往往需要共混或功能化。在未修饰的琼脂糖凝胶中，药物释放主要由通过水合网络的扩散控制，因此琼脂糖通常作为结构基质或扩散屏障，而非内在的刺激响应释放调节器。基于琼脂糖的材料已被研究作为生物载体，报道的释放策略包括被动缓释和pH、磁性或声响应递送。应区分这两种模式：被动缓释通常反映通过琼脂糖网络的扩散，而琼脂糖复合物中的刺激响应行为通常由添加的聚合物、纳米颗粒或官能团引入。例如，Philip等人开发的琼脂糖–聚丙烯酸杂化水凝胶用作胃肠道布洛芬递送的压敏黏附平台。琼脂糖构成热可逆结构相，聚丙烯酸提供大部分pH依赖性溶胀响应。研究发现，溶胀率从pH 1.2时的1.58±0.09增加到pH 7.4时的3.29±0.12，而压缩强度和杨氏模量随pH升高而降低。24小时后，pH 1.2时释放约15%布洛芬，pH 7.4时释放约65%。这些结果表明该制剂在体外条件下具有pH依赖性释放，但并未直接证明胃滞留、胃刺激减轻或体内肠道靶向。
3.3. 组织修复
琼脂糖基系统已被探索用于骨、软骨、皮肤、神经、骨软骨和感染骨修复。在大多数情况下，琼脂糖充当水合结构基质，并与明胶或GelMA、透明质酸、羟基磷灰石、导电聚合物、生长因子或抗菌成分结合，以弥补其有限的内在细胞黏附性和生物活性。例如，Mokhtarzade等人开发了一种四层可注射GelMA/琼脂糖梯度水凝胶支架，其中琼脂糖含量逐渐增加以实现从软骨下骨层到软骨层的连续过渡。GelMA主要提供光交联能力和细胞黏附基序，琼脂糖通过热凝胶化形成软骨样微环境并增强结构稳定性。支架可通过顺序注射和原位光交联制备，但可注射性和原位凝胶化仅作为材料加工性能得到证明，未在动物模型中评估微创骨软骨缺损修复。进一步研究表明，随着琼脂糖含量增加，水凝胶的压缩模量显著提高，表明琼脂糖有效增强水凝胶网络；SEM显示所有支架层均具有互联多孔结构，但梯度变化对细胞浸润、营养转运和ECM沉积的影响未被直接证明。短期细胞活力结果表明细胞相容性，但仍需长期细胞分布和体内骨软骨缺损研究来确定梯度结构是否改善组织整合和功能修复。
3.4. 免疫调节
免疫调节日益被认为是组织修复和生物材料整合的决定因素。植入材料可影响先天免疫细胞募集、巨噬细胞极化、异物反应、血管生成和重塑。琼脂糖基生物材料提供高度水合的物理网络、普遍良好的生物相容性和低的内在细胞黏附性。由于琼脂糖网络可通过物理凝胶化而非共价交联形成，可避免残留化学交联剂。琼脂糖水凝胶可通过其物理性质和掺入的线索影响免疫细胞行为。在Venkatachalam等人报道的酵母聚糖/ι-卡拉胶/琼脂糖系统中，TNF-α、CXCL10、TLR2和M2相关标志物的变化是在用酵母聚糖处理分化的THP-1巨噬细胞后测量的，而非用完整水凝胶处理，因此这些抗肿瘤、巨噬细胞相关效应主要归因于酵母聚糖。琼脂糖用作胶凝剂以稳定复合网络，ι-卡拉胶有助于凝胶稳定性和溶胀。巨噬细胞活化应被理解为动态谱系而非严格的两态系统，尽管M1样和M2样标签仍作为主要炎性和修复性表型的简写。琼脂糖基系统的免疫调节行为强烈依赖于物理化学性质，如刚度、孔径、表面化学和掺入的生物活性线索，但反应具有制剂和组织依赖性，不应推广至所有琼脂糖水凝胶。
3.5. 低温保存与细胞保护
传统哺乳动物细胞低温保存通常依赖含5–10% DMSO的冷冻培养基。DMSO可有效渗透细胞膜并减少细胞内冰晶形成，从而维持高解冻后存活率，但其细胞毒性、渗透压应激和细胞治疗产品中的潜在不良效应推动了无DMSO低温保存策略的发展。海藻糖是一种非渗透性冷冻保护剂，具有低毒性和强水替代及玻璃化效应，但由于膜通透性有限，单独使用通常对哺乳动物细胞保护不足。Wang等人研究了将哺乳动物细胞包封在含海藻糖的0.75%琼脂糖水凝胶中。琼脂糖基质减少了冰重结晶相关损伤，优化的琼脂糖/海藻糖条件在所报道的细胞系统中产生了与10% DMSO相当的解冻后存活率，但解冻后增殖仍较低。传统慢速冷冻可能引起渗透脱水、细胞内冰晶形成、解冻过程中冰重结晶和膜损伤。海藻糖主要通过玻璃化和水替代假说发挥冷冻保护作用，稳定蛋白质和细胞结构。琼脂糖水凝胶包封提供了一个受限微环境，限制冰晶生长并降低自由水流动性，从而提高解冻后细胞恢复。然而，较低的解冻后增殖以及缺乏广泛的细胞类型和规模化验证仍是重要限制。
4. 临床转化与当前应用
与海藻酸钠相比，海藻酸钠已在创面敷料产品中确立临床应用，而基于琼脂糖的可植入和再生系统仍主要处于临床前阶段。琼脂糖在电泳、生物分离和实验室诊断方面具有长期商业价值。琼脂糖广泛用作分子分离和生物分离的基质，而治疗性递送、可注射支架和再生植入物基本处于临床前或早期转化阶段。因此，更准确的说法是，琼脂糖是一种成熟的分析和生物分离材料，而非临床验证的可植入生物材料。琼脂糖水凝胶、纳米复合物、微球和可注射系统已被广泛研究用于抗癌药物、抗生素、抗炎剂和生物活性分子的控制递送。此外，由于其类细胞外基质三维结构、可注射性和生物打印能力，琼脂糖水凝胶已被广泛探索用于软骨修复、骨再生、骨软骨工程、皮肤修复、神经再生和细胞递送。另一新兴应用是细胞包封和保存。温和加工和多孔水凝胶网络使琼脂糖适用于微生物和哺乳动物细胞固定、类器官处理和冷冻保护。转化将需要跨细胞类型的验证、标准化的冷冻和解冻方案以及恢复后的长期功能评估。总体而言，离体分析和细胞处理应用更易于转化，而植入系统面临生物降解、灭菌、制造重现性和长期安全性的额外要求。
5. 挑战与未来展望
尽管基于琼脂糖的生物材料在药物递送、组织工程、诊断和低温保存领域发展迅速，但仍有几个关键挑战阻碍其更广泛的临床转化。主要限制之一是琼脂糖在哺乳动物体内降解性差，因为哺乳动物组织通常缺乏能有效降解琼脂糖网络的琼脂糖酶，长期植入可能导致材料持续存在和重塑不足。此外，天然琼脂糖的内在生物活性相对有限，缺乏细胞黏附基序，可能限制细胞附着、增殖和组织整合。复合系统可部分克服这些限制，但优化生物活性同时保持结构稳定性仍是重要挑战。黏附肽功能化和与GelMA或胶原共混可直接引入细胞结合位点，透明质酸改善水合和基质样特性，矿物填料特别适用于骨导向支架。然而，这些策略不一定解决琼脂糖降解缓慢的问题。第二个挑战是平衡机械性能、可注射性和可打印性。增加琼脂糖浓度可提高刚性和形状保持性，但可能降低细胞迁移、质量转运或可加工性。从转化角度看，大规模制造、灭菌、批次间重现性和监管途径对许多治疗性琼脂糖系统仍不充分。增加组成复杂性可能改善性能，但也使表征、制造控制和安全性评估复杂化。近期工作应优先考虑标准化配方、批次放行标准、灭菌兼容性以及机械性能、转运、释放和细胞反应的应用特定基准。长期研究应开发可控降解策略，在相关长期动物模型中评估重塑和生物安全性，并为临床预期系统建立可扩展的制造和监管途径。刺激响应递送、免疫指导支架、机械稳健但可加工的凝胶和微生理平台仍是有价值的研究方向，但其转化益处应相对于更简单的配方进行评估。
