编辑推荐：
脂肪组织来源的间充质基质细胞（AD-MSCs）的细胞衰老与慢性低度炎症、代谢功能障碍和脂肪形成受损相关，这些因素促进肥胖、胰岛素抵抗及年龄相关疾病的进展。本研究旨在建立基于AD-MSCs的细胞衰老模型，以研究天然漆黄素制剂的抗衰老（senolytic）功效，为
脂肪组织来源的间充质基质细胞（AD-MSCs）的细胞衰老与慢性低度炎症、代谢功能障碍和脂肪形成受损相关，这些因素促进肥胖、胰岛素抵抗及年龄相关疾病的进展。本研究旨在建立基于AD-MSCs的细胞衰老模型，以研究天然漆黄素制剂的抗衰老（senolytic）功效，为后续开发老年保护性治疗策略奠定基础。研究人员在复制性衰老和应激诱导衰老模型中评估了衰老标志物SA-β-gal、衰老相关分泌表型（SASP）因子以及细胞周期阻滞标志物p16、p21和p53。与LPS相比，H2O2被确定为AD-MSCs细胞衰老最有效的诱导剂。在H2O2诱导的AD-MSCs衰老模型中显示，未刺激的AD-MSCs中SA-β-gal+细胞比例为2.0（0.7）%，H2O2刺激的AD-MSCs中为81.7（12.1）%，而经短期（24小时）和长期（7天）漆黄素处理后分别为19.1（5.2）%和13.0（3.2）%，表明漆黄素处理与SA-β-gal+细胞比例降低相关。漆黄素处理导致MCP-1分泌显著降低，尤其是在长期孵育期间。与H2O2组相比，漆黄素处理7天后IL-1β显著降低，但24小时时的效应仅在漆黄素处理7天组中显著。漆黄素处理还与较高的p53和p21浓度相关。因此，本研究建立了H2O2诱导的AD-MSCs细胞衰老模型，该模型可用于评估衰老治疗制剂的老年保护潜力；在该模型中，漆黄素值得进一步评估作为潜在的衰老治疗药物。
基于AD-MSCs的细胞衰老模型研究及其漆黄素衰老治疗功效的解读
一、研究背景与目的
脂肪组织是一个异质性细胞系统，包含脂肪细胞、间充质基质细胞、巨噬细胞等免疫细胞、前脂肪细胞、内皮细胞、周细胞和成纤维细胞。脂肪组织细胞生理性分泌多种激素、酶和信号分子，直接参与内分泌、免疫调节和代谢，影响能量代谢、胰岛素敏感性等代谢功能。肥胖与衰老密切相关，肥胖患病率随年龄增长而增加，加剧高血压、糖尿病和冠心病风险，导致机体衰老和过早死亡。脂肪组织来源的间充质基质细胞（AD-MSCs）提供功能可塑性并维持脂肪组织稳态。AD-MSCs的细胞衰老与增殖潜力下降及氧化应激、自噬损伤、线粒体功能障碍和表观遗传修饰等因素引起的DNA损伤反应相关，促成衰老相关分泌表型（SASP）的形成，进而导致AD-MSCs衰老表型、慢性低度炎症和脂肪形成受损。因此，AD-MSCs功能障碍促进肥胖、胰岛素抵抗和年龄相关疾病的进展。目前，细胞衰老机制的研究旨在识别最可靠的衰老细胞生物标志物、开发生物学年龄评估算法及新型衰老治疗策略。鉴于细胞衰老的异质性，建议联合评估细胞周期阻滞标志物、SA-β-gal活性和SASP成分。间充质干细胞（MSCs）的细胞衰老研究具有重要意义，因为其广泛参与维持组织稳态、免疫调节和再生。具有衰老清除和衰老调节作用的制剂是应对细胞衰老的有前景的途径，但针对MSC衰老的疗法仍需深入研究。天然多酚类制剂备受关注，其中漆黄素是研究最广泛的制剂之一，多项初步临床试验显示其对衰老标志物的有效性且副作用极小。本研究旨在建立基于AD-MSCs的细胞衰老模型，确定最有效的细胞衰老生物标志物，并研究天然漆黄素制剂的衰老清除功效，以制定老年保护性治疗策略。
二、关键技术方法
研究人员从8名平均年龄37.0（3.3）岁的受试者皮下腹部脂肪组织中获取脂肪组织样本，排除标准为年龄小于70岁、糖尿病、严重慢性疾病和合并症。分离获得AD-MSCs后，通过成脂、成骨和成软骨三向分化能力鉴定其MSC特性。复制性衰老模型通过对AD-MSCs长期传代培养直至第20代实现。应激诱导衰老模型使用1 μg/mL脂多糖（LPS）或50 μM过氧化氢（H2O2）处理细胞24小时，随后更换培养基继续培养7天。细胞活力采用刃天青（resazurin）比色法检测。衰老标志物评估包括SA-β-gal染色（使用商业化试剂盒，并结合ImageJ软件进行图像自动分析）、通过ELISA检测培养上清液中SASP因子（IL-1β、IL-6、IL-8、MCP-1/CCL2、TNF-α）的分泌水平，以及通过ELISA检测细胞裂解液中细胞周期阻滞标志物p21、p16和p53的浓度。漆黄素制剂为100 mg胶囊（GraFLab，莫斯科，俄罗斯），溶于DMSO后用培养基稀释，最终DMSO浓度不超过0.001%。实验采用0–300 μM浓度梯度确定剂量依赖性效应和细胞毒性，后续实验选用50 μM浓度。所有实验设8个生物学重复，每个受试者测量3个技术重复并取均值。统计分析采用SPSS 27.0，正态分布检验采用Shapiro–Wilk检验，组间比较采用Student's t检验，数据以均值（标准差）表示，p < 0.05为差异有统计学意义。
三、研究结果
（一）复制性细胞衰老模型
在复制性衰老模型中，研究人员在AD-MSCs第2代（培养第10天）、第6代（第42天）、第12代（第95天）和第18代（第140天）测定了SA-β-gal阳性细胞比例、SASP因子（IL-1β、TNF-α、MCP-1）分泌水平以及细胞周期阻滞标志物p16、p21、p53浓度。结果显示，与第2代相比，第6代时SA-β-gal+细胞比例显著增加（p = 0.001），整个培养期间SA-β-gal+细胞数量持续增加，第12代和第18代差异显著（p < 0.001）。SASP因子分泌方面，IL-1β水平在第12代和第18代较第2代显著升高（分别p < 0.001和p < 0.05），TNF-α无显著变化，MCP-1在第12代无显著升高，第18代显著升高（p < 0.05）。细胞周期阻滞标志物方面，p16水平在第18代较第2代显著升高；p21和p53水平在第12代和第18代较第2代均显著升高（p < 0.05）。由此可见，长期传代可诱导AD-MSCs出现典型的复制性衰老特征。
（二）应激诱导细胞衰老模型
应激诱导衰老研究在第3代AD-MSCs中进行，通过LPS或H2O2刺激24小时。结果显示，与未刺激对照组相比，应激诱导后SA-β-gal+细胞比例显著增加。对照组SA-β-gal+细胞比例为1.3（0.3）%，LPS刺激组为9.0（1.0）%（p < 0.001），H2O2刺激组为76.9（4.3）%（p < 0.001）。H2O2刺激组的SA-β-gal+细胞比例显著高于LPS刺激组。LPS和H2O2刺激均导致SASP因子MCP-1和IL-6分泌显著增加，LPS刺激还使TNF-α分泌显著增加。H2O2刺激使细胞裂解液中细胞周期阻滞标志物浓度显著升高，而LPS刺激未引起显著变化。两种刺激方法在SASP因子分泌和细胞周期阻滞标志物浓度方面效果相当，但H2O2在增加SA-β-gal+细胞比例方面显著更有效，因此H2O2被选为进一步实验的细胞衰老诱导剂。
（三）漆黄素在应激诱导衰老模型中的衰老清除功效
在H2O2诱导的AD-MSCs应激衰老模型中，与未刺激对照组相比，H2O2刺激使SA-β-gal+细胞比例显著增加（p < 0.001）。H2O2刺激细胞经漆黄素处理24小时或7天后，SA-β-gal+细胞比例较未用漆黄素处理的H2O2刺激细胞显著降低（p < 0.001）。具体而言，未刺激AD-MSCs中SA-β-gal+细胞比例为2.0（0.7）%，H2O2诱导且未经漆黄素处理的细胞中为81.7（12.1）%，短期漆黄素处理后为19.1（5.2）%，长期漆黄素处理后为13.0（3.2）%。漆黄素对SASP因子分泌的影响：漆黄素孵育第一天即可使H2O2刺激的MCP-1分泌显著降低，长期孵育后降低更为显著；IL-8分泌在漆黄素处理24小时后显著降低，但7天后显著升高（无论是否接受漆黄素处理）；IL-1β分泌在漆黄素处理7天后显著降低；TNF-α和IL-6分泌无显著变化。细胞周期阻滞标志物方面，H2O2刺激使p16、p21和p53浓度显著升高。漆黄素处理使p16浓度略有下降（短期和长期均不显著），p53浓度略有升高（24小时和7天均不显著），p21浓度显著升高（24小时和7天均显著，p < 0.05）。这表明漆黄素可有效减少SA-β-gal阳性细胞，并部分调节SASP因子，但p21和p53的升高提示其作用机制可能涉及凋亡通路的激活。
四、讨论与结论
本研究表明，H2O2是较LPS更有效的AD-MSCs细胞衰老诱导剂，这与H2O2作为氧化应激诱导剂的能力相关。SA-β-gal是识别衰老细胞最常用的生化标志物，但其不决定衰老机制。漆黄素处理可显著降低H2O2诱导的SA-β-gal+细胞比例，显示其高效的衰老清除活性；但对SASP因子和细胞周期阻滞标志物的影响存在矛盾结果，例如MCP-1降低而IL-8升高，p53和p21升高。既往研究显示，漆黄素的衰老清除活性源于激活凋亡通路，如PI3K/AKT和Bcl-2家族成员，并可诱导p53和p21水平升高。因此，本研究观察到的p53和p21升高不应直接视为促衰老活性，而可能反映了漆黄素诱导凋亡的机制。本研究的局限性包括：衰老标志物范围较窄，未评估衰老相关异染色质灶、γH2AX、脂褐素、端粒长度和端粒酶活性；且AD-MSCs仅来源于一组平均年龄37.0（3.3）岁的肥胖患者。未来研究应比较不同年龄组、不同体质指数和不同肥胖程度受试者的AD-MSC衰老参数，并深入探究AD-MSC衰老的转录组机制及在动物模型和临床试验中评估衰老治疗制剂的效果。总之，MSCs在维持机体稳态、促进组织再生和炎症反应平衡中发挥重要作用。本研究建立了H2O2诱导的AD-MSCs细胞衰老模型，可用于评估制剂和天然产物对抗AD-MSCs细胞衰老的潜力，以开发新的衰老治疗策略，这是健康长寿预防医学领域的优先研究方向。漆黄素作为靶向AD-MSC衰老的潜在衰老治疗药物值得进一步研究。该论文发表于《Cells》。
