矩阵引导的等离激元纳米探针尺寸选择以提升SERS侧向层析免疫分析的定量稳健性

《Foods》：Matrix-Guided Size Selection of Plasmonic Nanoprobes for Improving Quantitative Robustness of SERS Lateral Flow Immunoassays

　　

中文摘要翻译 基于表面增强拉曼散射的侧向层析免疫分析（SERS-LFIA）已成为食品安全快速分析中极具前景的平台。然而，其定量可靠性常因侧向层析过程中的基质依赖性变化而受损，且探针尺寸对分析性能的影响仍未被充分理解。本研究制备了直径为15、30和50 nm的Au@DTNB免疫探针，系统考察了纳米颗粒尺寸对黄曲霉毒素B1（AFB1）检测中SERS-LFIA定量性能的影响。三种尺寸的探针均表现出优异的浓度依赖性响应，并生成了相关系数（R2）分别为0.997、0.994和0.992的四参数逻辑校准曲线。尽管50 nm探针产生了最强的拉曼信号，但在大米和大豆样品中的加标回收实验表明，15 nm探针提供了最高的定量准确度，回收率分别为90.1%–109.2%和100.4%–108.9%，相对标准偏差低于7.2%。相比之下，较大尺寸的探针尽管具有更强的SERS响应，但其测定值与加标浓度之间的偏差逐渐增大。这些结果表明，仅最大化拉曼信号强度并不一定能改善复杂食品基质中的定量性能。相反，探针尺寸应根据基质特性进行优化，以实现可靠的定量分析。本研究建立了面向基质的探针尺寸选择策略，为食品安全分析中定量SERS-LFIA平台的合理设计提供了实用指导。

论文解读文章

一、研究背景与问题提出

侧向层析免疫分析（Lateral Flow Immunoassay, LFIA）凭借低成本、便携性、快速响应和操作简便等优势，已成为应用最广泛的即时检测（Point-of-Care, POC）技术之一，在食品安全监测、环境分析和临床诊断等领域具有广阔的应用前景。然而，传统LFIA主要依赖基于胶体金纳米颗粒的比色读出方式，这从根本上限制了其分析灵敏度和定量准确度。比色信号在低分析物浓度下往往分辨率较差，且易受背景干扰和主观判读的影响。因此，如何同时提高灵敏度和定量可靠性，一直是LFIA发展中的核心挑战。

表面增强拉曼散射（Surface-Enhanced Raman Scattering, SERS）因其超高灵敏度、分子指纹特异性和与侧向层析格式的兼容性，被广泛探索作为克服上述局限的信号转导策略。SERS-LFIA已在多种分析物的检测中展现出显著提升的检测性能。然而，在实际应用中实现稳健的定量分析仍面临挑战，信号波动和环境扰动经常损害测量可靠性。

为应对这些局限，研究者投入大量精力设计具有增强信号强度和改善信号稳定性的SERS纳米标签，开发了包括核壳纳米颗粒、纳米星、纳米簇和中空纳米结构等多种等离激元结构。虽然这些策略在纳米颗粒水平上显著提升了信号强度，但SERS-LFIA的定量性能并不仅仅由内在信号特性决定。作为一种动态色谱系统，SERS-LFIA涉及纳米颗粒在多孔硝酸纤维素膜中的连续传输，随后在检测线处进行免疫识别和累积。因此，最终的定量信号不仅取决于单个探针的拉曼响应，还取决于成功传输并被捕获在检测区域内的探针数量。

由于纳米颗粒在SERS-LFIA中的传输和捕获是在多孔膜的连续流动条件下进行的，这些过程对周围的物理化学环境高度敏感。在实际应用中，样品基质的差异会显著影响流体传输行为、纳米颗粒迁移率和膜-颗粒相互作用，从而影响探针在检测线处的累积和信号形成。由于这些传输和捕获过程本质上具有尺寸依赖性，不同尺寸探针对基质变化的响应预计会有所不同，这表明探针尺寸的选择可能对不同样品基质中的定量可靠性产生关键影响。然而，关于基质依赖性传输行为如何主导SERS-LFIA中探针尺寸选择的系统理解仍然缺乏。该论文发表于《Foods》期刊。

二、主要技术方法

研究人员采用了几项关键技术方法开展研究：一是经典Frens柠檬酸盐还原法合成15 nm金纳米颗粒（AuNPs），并通过羟胺介导的种子生长法制备30 nm和50 nm尺寸可控的AuNPs；二是将5,5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)（DTNB）作为拉曼报告分子通过Au-S键修饰到不同尺寸AuNPs表面，再通过静电吸附偶联抗AFB₁单克隆抗体构建SERS免疫探针；三是组装SERS-LFIA试纸条，将AFB₁-BSA偶联物和山羊抗小鼠IgG分别喷涂于硝酸纤维素膜上作为检测线（T线）和质控线（C线）；四是采用785 nm激发波长的拉曼光谱仪直接从检测线采集SERS信号，以DTNB在1330–1332 cm^?1处的特征拉曼峰作为定量信号；五是在大米和大豆真实样品中进行加标回收实验验证定量准确性。

三、研究结果

3.1 不同尺寸Au@DTNB SERS纳米标签的构建与表征

研究人员合成了平均直径分别为15、30和50 nm的球形金纳米颗粒，并通过Au-S相互作用修饰DTNB构建了尺寸依赖的Au@DTNB纳米标签。透射电子显微镜（TEM）表征显示所有纳米颗粒在DTNB修饰后均呈现规则的球形形貌、光滑表面和良好的单分散性，未观察到明显聚集或结构变形。紫外-可见（UV-vis）吸收光谱显示，随着纳米颗粒尺寸从15 nm增大到50 nm，局域表面等离激元共振（LSPR）峰从524 nm逐渐红移至534 nm和542 nm，与球形金纳米颗粒的尺寸依赖性等离激元行为一致。拉曼光谱分析表明，三种尺寸的纳米标签均表现出DTNB的特征拉曼指纹图谱，其中约1331 cm^?1处的拉曼峰强度最高且光谱分辨率优异，被选为后续定量SERS-LFIA测量的分析信号。拉曼强度随纳米颗粒尺寸增大而逐渐增强，表明更大尺寸的等离激元纳米颗粒具有更强的电磁场放大效应。

3.2 不同尺寸Au@DTNB免疫探针的表征

研究人员通过静电吸附将抗AFB₁单克隆抗体固定到Au@DTNB纳米标签上构建SERS免疫探针。动态光散射（DLS）测量显示，每种纳米颗粒尺寸在DTNB修饰和抗体偶联后水合直径均逐渐增大，且粒径分布在整个修饰过程中保持相对狭窄，表明探针制备未引起明显聚集。UV-vis吸收光谱显示，每种纳米颗粒尺寸在DTNB修饰和抗体固定后LSPR吸收峰均出现轻微红移，且无明显峰展宽，表明探针在表面功能化过程中保持良好的胶体分散性。Zeta电位测量显示，DTNB修饰使纳米颗粒带更多负电荷，抗体固定后绝对电位降低，但所有免疫探针仍保持足够的负电荷以维持胶体稳定性。这些表征结果一致证实了不同尺寸Au@DTNB免疫探针的成功制备，同时排除了探针制备过程对后续分析性能的影响。

3.3 不同尺寸SERS免疫探针的基质依赖性信号稳定性

研究人员选取分析缓冲液、纤维素悬浮液、淀粉悬浮液和大豆蛋白提取液四种代表性空白基质，采用相同SERS-LFIA流程评估不同尺寸免疫探针的信号稳定性。结果显示，三种尺寸的探针在四种基质中均获得了清晰的检测线和质控线，表明所有免疫探针均保持良好的色谱迁移和免疫识别能力。然而，四种基质间检测线颜色强度存在差异，且这种差异程度随探针尺寸增大而增加。15 nm探针在所有基质中表现出几乎一致的拉曼强度，信号稳定性优异；30 nm探针表现出中等程度的基质依赖性波动；50 nm探针则表现出最大的信号变异，在纤维素基质中拉曼强度最高，在大豆蛋白提取液中显著降低。由于实验采用了相同的拉曼报告分子、探针制备程序和测量条件，观察到的信号差异归因于探针在色谱迁移过程中传输和累积行为的差异。较大纳米颗粒在多孔硝酸纤维素膜中预期经历更强的空间位阻和与基质组分更强的相互作用，导致到达检测线的探针数量变异性增大。

3.4 SERS-LFIA的探针尺寸依赖性定量响应

研究人员使用15、30和50 nm Au@DTNB免疫探针进行竞争性免疫分析以评估定量响应。随着AFB₁浓度从0增加到15 ng mL^?1，三种探针尺寸的检测线颜色强度均逐渐减弱，而质控线始终保持清晰可见。对应的SERS光谱显示，约1332 cm^?1处DTNB特征拉曼峰随AFB₁浓度增加而逐渐降低，反映了游离AFB₁竞争性抑制探针结合导致检测线上捕获的免疫探针数量减少。三种探针尺寸均表现出典型的S形浓度-响应关系，并通过四参数逻辑模型良好拟合，相关系数（R²）分别为0.997（15 nm）、0.994（30 nm）和0.992（50 nm）。检出限（LOD）分别为0.034、0.047和0.017 ng/mL，定量限（LOQ）分别为0.250、0.692和0.175 ng/mL。在相同测定条件下，15 nm免疫探针在整个浓度范围内产生最低的拉曼强度，而50 nm免疫探针产生最强的SERS响应，30 nm探针处于中间水平。

3.5 真实样品中探针尺寸依赖性定量性能的验证

研究人员在大米和大豆样品中进行加标回收实验，以评估标准条件下建立的校准模型能否准确预测实际样品中的分析物浓度。在大米样品中，15 nm免疫探针的回收率为90.1%–109.2%，RSD为3.3%–5.4%；30 nm探针的回收率为101.9%–122.4%；50 nm探针的回收率进一步升高至125.5%–133.2%。在大豆样品中，15 nm免疫探针的回收率为100.4%–108.9%，而30 nm和50 nm探针的回收率分别升高至107.1%–122.4%和135.7%–149.8%。所有测定的RSD均低于7.2%。尽管三种探针尺寸在标准条件下均表现出优异的校准性能，但真实样品中的回收率存在明显差异。15 nm免疫探针始终产生最接近加标值的回收率，而随着探针尺寸增大，回收率逐渐偏离，尽管较大纳米颗粒产生了更强的拉曼信号。交叉反应实验显示，检测响应主要由抗体介导的竞争性识别决定，对结构相关的黄曲霉毒素存在一定程度的交叉反应，而对赭曲霉毒素A（OTA）、玉米赤霉烯酮（ZEA）、T-2毒素和HT-2毒素的响应接近空白值。

四、讨论总结与结论翻译

讨论总结： 研究结果表明，虽然增大纳米颗粒尺寸能显著增强单个SERS免疫探针的内在拉曼信号强度，但更强的拉曼信号并不必然转化为更优的定量准确度。在标准缓冲液条件下，三种尺寸探针均表现出良好的校准性能，但在实际食品样品分析中出现了明显差异。复杂样品提取物可能改变探针分散性、非特异性相互作用、色谱迁移和抗体-抗原竞争性结合，从而改变拉曼响应与分析物浓度之间的关系，且这种效应随探针尺寸增大而愈加显著。因此，探针尺寸应根据基质条件进行优化，而非仅依据拉曼增强能力来选择。

研究结论： 本研究利用直径为15、30和50 nm的Au@DTNB免疫探针，系统考察了不同基质条件下探针尺寸对SERS-LFIA定量性能的影响。尽管增大纳米颗粒尺寸显著增强了内在SERS信号强度，但更强的拉曼信号并不一定转化为更高的定量准确度。三种探针尺寸在标准条件下均表现出令人满意的校准性能，而在实际样品分析中观察到明显差异。大米和大豆样品的回收实验表明，15 nm免疫探针提供了最准确可靠的定量结果，表明其对复杂食品基质具有优越的适应性。这些发现揭示了探针尺寸是控制SERS-LFIA定量可靠性的关键因素，应根据基质条件而非仅依据拉曼增强能力进行优化。该研究为探针尺寸选择提供了实用策略，为食品安全分析中可靠的SERS-LFIA平台的合理设计提供了有益指导。