《Foods》：Biodiversity of NSLAB in Traditional Serbian Cheeses and Stepwise Functional Characterization of Selected Autochthonous Lactobacillus Strains Through Technological, Probiotic and Intestinal Epithelial Interaction Assessment
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传统奶酪代表了复杂的微生物生态系统和具有功能潜力的本土乳酸菌（LAB）的宝贵资源。本研究表征了从传统塞尔维亚生奶奶酪中分离的非发酵剂乳酸菌（NSLAB）的生物多样性，并通过一种结合安全性评估、技术特性评价、益生菌评估以及与Caco-2肠上皮细胞体外相互作用的分
传统奶酪代表了复杂的微生物生态系统和具有功能潜力的本土乳酸菌（LAB）的宝贵资源。本研究表征了从传统塞尔维亚生奶奶酪中分离的非发酵剂乳酸菌（NSLAB）的生物多样性，并通过一种结合安全性评估、技术特性评价、益生菌评估以及与Caco-2肠上皮细胞体外相互作用的分步方法，筛选出有前景的本土乳杆菌属菌株。从56株推定LAB分离物中，RAPD-PCR区分出37种不同的基因型，所有基因型均通过16S rRNA基因测序进行了分类学鉴定。根据本研究对本土乳杆菌的特定关注点，所有七株分类学上归属于该属的分离物被选作进一步表征。安全性评估显示，两株菌（28.6%）形成生物膜并被排除，而其余五株分离物符合欧洲食品安全局（EFSA）的抗生素敏感性标准。这些候选菌株表现出菌株依赖性的αs1-和β-酪蛋白组分降解能力以及中度的牛奶酸化能力。四株菌在模拟胃肠道转运后存活，对食源性病原体具有拮抗活性，并能粘附于Caco-2细胞而不诱导细胞毒性。Lactiplantibacillus plantarum ZI237展现出最广泛的自噬相关转录响应和NQO1的诱导作用。Limosilactibacillus fermentum KT上调了MUC2、MUC5、NQO1和HBD-1，但降低了Occludin蛋白丰度，表明其引发了混合性上皮反应。两株菌均降低了p62蛋白水平，支持其对自噬相关通路的调节作用。总体而言，Lpb. plantarum ZI237成为最有前景的候选菌株，而Lm. fermentum KT在应用于功能性乳制品之前需要进一步评估。
论文解读：传统塞尔维亚奶酪中非发酵剂乳酸菌的挖掘与功能评价
1. 研究背景
传统奶酪，特别是采用生乳制作的农家奶酪，蕴含着复杂且多样的微生物群落，是非发酵剂乳酸菌（NSLAB）的重要天然储库。这些NSLAB不仅通过产酸、蛋白水解和脂肪水解等代谢活动塑造了传统奶酪独特的风味和质地，其中一些菌株还被认为具备潜在的益生特性。然而，尽管西巴尔干地区（包括塞尔维亚）的传统奶酪历史悠久，对其中的NSLAB，尤其是乳杆菌属（Lactobacillus）菌株的系统性功能挖掘仍不充分。目前存在的问题在于：许多潜在的功能性菌株缺乏全面的安全性评估、技术适用性评价以及其对宿主肠道健康影响的深入理解。因此，开展这项研究旨在系统性地表征传统塞尔维亚奶酪中NSLAB的生物多样性，并通过一套结合安全、技术与益生特性的分步筛选流程，甄选出最具应用潜力的本土乳杆菌，为开发新型功能性乳制品提供优质的菌种资源。
2. 主要关键技术方法
研究人员采用了多步骤的表征策略。首先，从塞尔维亚11个不同地点的传统生奶奶酪（包括牛奶奶酪和山羊奶奶酪）中分离细菌。利用随机扩增多态性DNA聚合酶链式反应（RAPD-PCR）技术对56株推定乳酸菌进行基因分型，并结合16S rRNA基因测序进行物种鉴定。随后，针对筛选出的乳杆菌，开展了安全性评估（包括生物膜形成能力测定和抗生素敏感性测试）、技术特性评价（包括对αs1-和β-酪蛋白的蛋白水解活性以及在脱脂乳中的酸化能力）、以及益生特性表征（包括模拟胃肠道环境下的存活率试验、对六种指示性病原菌的抗菌活性和对人结肠腺癌细胞系Caco-2的粘附能力）。最后，通过实时定量聚合酶链式反应（qPCR）和蛋白质印迹法（Western blotting）评估了乳杆菌与Caco-2细胞互作后对自噬、屏障功能和抗氧化等相关基因及蛋白表达的影响。
3. 研究结果
3.1. 奶酪采样与细菌分离
从11种传统奶酪中获得56株革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性的乳酸菌（LAB）分离物。
3.2. RAPD-PCR图谱分析
RAPD-PCR将56株菌分为四个主要簇群（A-D），共产生37种不同基因型。部分分离物指纹图谱相同，表明存在重复菌株。未观察到聚类与奶酪的地理来源或奶源类型有关。
3.3. 选定分离物的鉴定
16S rRNA基因测序鉴定了37株代表菌株。结果显示，肠球菌属（Enterococcus）占主导地位（51.35%，主要为E. faecium），其次为乳球菌属（Lactococcus，13.51%）、明串珠菌属（Leuconostoc，13.51%）、乳杆菌属（Lactobacillus，18.92%）和链球菌属（Streptococcus，2.70%）。根据研究重点，所有7株乳杆菌被选中进行后续功能表征，包括3株Lactiplantibacillus plantarum、2株Lacticaseibacillus paracasei、1株Lacticaseibacillus rhamnosus和1株Limosilactibacillus fermentum。
3.4. 安全性评估
通过结晶紫染色法测定生物膜形成能力，Lpb. plantarum ZI337和Lcb. paracasei KB被判定为生物膜形成菌株（OD595 ≥ 0.2），因而被排除。其余5株菌均符合欧洲食品安全局（EFSA）设定的抗生素敏感性断点值，被认为是安全的。
3.5. 技术特性表征
蛋白水解活性：SDS-PAGE分析显示，Lpb. plantarum ZI237和Lcb. rhamnosus KO对αs1-和β-酪蛋白均表现出最高的降解活性。其他菌株显示出不同程度的降解或无活性。
酸化能力：所有5株菌在脱脂乳中培养6小时和24小时后，均未表现出强酸化能力，属于中度酸化菌株。其中，Lcb. rhamnosus KO在24小时后使pH下降最多（至4.81）。
3.6. 益生特性表征
模拟胃肠道条件下的存活率：除Lcb. paracasei KR外，其余4株菌在模拟胃液、十二指肠液和肠液处理后均能存活。Lpb. plantarum ZI237在全程表现出最高的存活率（最终为55.92%）。
抗菌活性：琼脂扩散实验表明，4株菌的抗菌活性并非由细菌素介导。Lpb. plantarum ZI137、ZI237和Lcb. rhamnosus KO可抑制5/6种病原菌，而Lm. fermentum KT仅抑制2/6种。所有菌株均能抑制单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）。
3.7. 与人肠道细胞的相互作用
粘附和细胞毒性：所有4株菌均能有效粘附于Caco-2细胞，其中Lpb. plantarum ZI137粘附能力最强。乳酸脱氢酶（LDH）检测证实，所有菌株均未引起细胞毒性。
对自噬相关基因和蛋白表达的影响：qPCR结果显示，Lpb. plantarum ZI237显著上调了多个参与自噬起始、成核和延伸阶段的基因（如ULK1, BECN1, ATG5），并下调p62基因表达。Lm. fermentum KT也上调了BECN1等基因并下调p62。Western blotting证实，这两株菌均显著降低了p62蛋白水平，表明它们调节了自噬相关通路。
对黏蛋白、抗菌肽和抗氧化相关基因表达的影响：Lm. fermentum KT显著上调了MUC2、MUC5、HBD-1和NQO1基因。Lpb. plantarum ZI237则仅显著诱导了NQO1的表达。
对上皮屏障相关蛋白的影响：Western blotting分析显示，Lm. fermentum KT处理导致紧密连接蛋白Occludin的丰度显著降低，而对E-cadherin和Claudin-4无显著影响。Lpb. plantarum ZI237对所检测的三种蛋白均无显著影响。
4. 讨论与结论
讨论部分指出，传统奶酪是NSLAB的丰富来源，其中肠球菌的高比例可能与其较强的环境耐受性有关。本研究中乳杆菌的分布相对有限，但筛选出的菌株展现出了菌株特异性的功能潜力。研究强调，虽然生物膜形成在某些环境下有益，但在食品加工中通常被视为不利特征而被剔除。所有受试菌株对抗生素的敏感性良好，符合安全要求。蛋白水解和酸化能力的结果表明，这些菌株更适合作为辅助发酵剂或益生菌补充剂，而非强效的主发酵剂。在模拟胃肠道消化中的高存活率，尤其是Lpb. plantarum菌株，证实了其良好的耐受力。抗菌活性主要由有机酸等非细菌素物质介导，对李斯特菌的抑制作用具有重要的生物保藏意义。所有菌株对Caco-2细胞的有效粘附且无毒性，是其作为益生菌候选者的重要前提。在对肠道细胞互作的分析中，Lpb. plantarum ZI237展现了最广泛的自噬相关基因调控能力，而Lm. fermentum KT则在促进黏膜屏障和先天防御方面表现突出，但其对Occludin蛋白的下调作用提示其对屏障完整性的整体影响需谨慎评估，需借助跨上皮电阻（TEER）等功能性实验进一步验证。
研究结论：本研究证实了传统塞尔维亚奶酪是多样化本土乳酸菌的重要储库。七株分离的乳杆菌在安全性、技术和益生潜力方面表现出不同程度的特性。Lpb. plantarum ZI237因其安全性、在模拟胃肠条件下的存活率、拮抗活性、蛋白水解潜力以及对抗氧化防御和自噬相关基因的调节作用（并在蛋白水平上通过降低p62表达得到证实）而成为最有前景的菌株。Lm. fermentum KT也成为一个相关的候选者，尤其是在刺激黏膜屏障、先天上皮防御和抗氧化防御相关基因方面的能力，同时展现出与自噬相关的效应。然而，Occludin蛋白丰度的显著降低表明，Lm. fermentum KT对上皮屏障完整性的总体影响应谨慎解读，并需要使用功能性屏障测定法进行进一步研究。总体而言，Lpb. plantarum ZI237成为最全面的候选菌株，而Lm. fermentum KT则表现出一种混合性上皮反应，值得进一步评估。尽管如此，还需要更多研究来确认它们在食品体系中的性能，并在更复杂的体外和体内模型中进一步验证其效果。该论文发表于《Foods》。
