怀菊花多酚提取物对食源性病原菌的抗菌活性及细胞效应

《Foods》：Antibacterial Activity and Cellular Effects of Huai Chrysanthemum Polyphenol Extract Against Foodborne Pathogens

　　

淮菊花（Chrysanthemum morifolium Ramat. cv. Huaiju）采自中国河南省焦作市，是一种富含酚类化合物的药食两用植物。多酚是具有潜在抗菌活性的天然生物活性化合物。本研究采用高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）对怀菊花多酚提取物中的酚类化合物进行了定性和定量分析，并评价了其对代表性革兰氏阴性菌和革兰氏阳性食源性细菌的抗菌活性。共鉴定出22种多酚类化合物，包括10种酚酸、10种黄酮类化合物和2种其他酚类化合物。咖啡酸是主要的酚酸，而木犀草苷是主要的黄酮类化合物。黄酮类化合物占总鉴定多酚的94.03%。该提取物对大肠杆菌（Escherichia coli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的生长均有抑制作用，对两株菌的MIC₈₀均为12.5 mg/mL。进一步分析表明，该提取物降低了胞内蛋白含量和ATP水平，增加了胞外碱性磷酸酶活性，改变了细胞表面电荷，影响了超氧化物歧化酶活性，并引起了细菌细胞显著的形态学变化。这些结果表明，怀菊花多酚提取物的抗菌作用与细胞包膜损伤、能量代谢紊乱和氧化还原失衡有关。本研究为怀菊花多酚提取物作为天然抗菌成分在食品保鲜中的进一步应用提供了依据。

怀菊花多酚提取物对食源性病原菌的抗菌活性及细胞效应——论文解读

一、研究背景与问题

怀菊花（Chrysanthemum morifolium Ramat. cv. Huaiju）为菊科植物，干燥头状花序，是我国传统药食两用植物，主产于河南省，被列为四大怀药之一。现代研究表明，菊花富含酚酸、黄酮、类胡萝卜素等生物活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗菌、保肝和降压等作用。在菊花中，咖啡酰奎宁酸和黄酮类化合物被认为是主要的生物活性成分。然而，以往对菊花的研究多集中于化学成分表征、抗氧化能力、抗炎活性、降糖活性、保肝作用或不同品种间的总生物活性比较，对怀菊花多酚提取物抗菌机制的报道尚不充分。已有一些研究报道了菊花提取物或精油的抗菌活性，但多侧重抑菌圈或最低抑菌浓度（MIC）值，较少深入探讨其对细菌细胞膜的完整性、表面电荷、胞内蛋白质泄漏、ATP稳态、碱性磷酸酶释放、氧化应激反应及细胞形态的影响。由于缺乏系统的机理性研究，怀菊花多酚提取物作为天然抗菌成分的开发与应用受到限制。植物多酚的抗菌效应通常与细菌细胞包膜相互作用、膜通透性改变、胞内成分泄漏、能量代谢紊乱及氧化应激反应有关。大肠杆菌（Escherichia coli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）分别作为革兰氏阴性菌（Gram?）和革兰氏阳性菌（Gram+）的代表，在细胞包膜结构上存在显著差异，非常适合用于比较不同包膜特性细菌的抗菌反应。基于此，研究人员制备了怀菊花多酚提取物，表征其酚类组成，并从多种生理生化指标层面阐明其对两种食源性致病菌的抗菌作用机制。

二、研究设计

该论文发表于《Foods》。研究材料采自河南焦作的怀菊花干燥头状花序，经80%乙醇提取、减压浓缩和冷冻干燥制得怀菊花多酚提取物。采用超高效液相色谱-四极杆静电场轨道阱质谱联用（UPLC-Q Exactive MS）技术，在负离子模式下对提取物中酚类化合物进行鉴定和定量。抗菌活性测定采用牛津杯法、微量稀释法测定MIC₈₀，并监测24 h生长曲线。机制研究包括：BCA法测定胞外蛋白泄漏、Zeta电位仪测定细菌表面电荷变化、试剂盒法测定胞外碱性磷酸酶（AKP）活性、胞内ATP含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量，利用扫描电镜（SEM）和透射电镜（TEM）观察细胞形态和超微结构损伤，并通过SDS-PAGE分析胞内蛋白谱变化。所有实验均进行三次独立生物学重复，数据采用单因素方差分析和Duncan多重比较检验。

三、主要研究结果

3.1 怀菊花多酚提取物的酚类组成

LC-MS/MS分析共鉴定出22种酚类化合物，包括10种酚酸（咖啡酸、丁香酸、对香豆酸、水杨酸、反式阿魏酸、芥子酸、没食子酸、原儿茶酸、香草酸、4-羟基苯甲酸）、10种黄酮类化合物（木犀草素、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素、木犀草苷、牡荆素、异鼠李素、柚皮素、二氢槲皮素、芹菜素、二氢山柰酚）以及2种其他酚类化合物（白藜芦醇、丁香醛）。黄酮类化合物占总多酚的94.03%，其中木犀草苷含量最高，达1869.95 ng/mg提取物，占总黄酮的62.92%；芹菜素、槲皮素-3-O-葡萄糖苷和木犀草素次之，分别占总黄酮的11.96%、11.80%和11.76%。酚酸中咖啡酸为主导化合物，含量为120.24 ng/mg提取物。该结果表明怀菊花多酚提取物是一种富含黄酮的酚类混合物，具有独特的酚类特征。

3.2 抗菌活性与MIC₈₀

牛津杯抑菌圈实验显示，提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均形成清晰抑菌圈，且抑菌圈直径随提取物浓度升高而增大。25 mg/mL时，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径分别达22.97 mm和16.48 mm。生长抑制实验中，两种菌的抑制率随浓度增加而升高；12.5 mg/mL时，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制率分别达到84.14%和81.65%。据此确定提取物对两株菌的MIC₈₀均为12.5 mg/mL。

3.3 对细菌生长曲线的影响

与对照组相比，MIC₈₀处理延迟了对数生长期并降低了细菌增殖量，2MIC₈₀处理组在整个监测期间的OD₆₀₀值均低于MIC₈₀组，呈浓度依赖性抑制效应，进一步证实了提取物对两种食源性细菌的增殖抑制活性。

3.4 对细菌细胞膜的影响

提取物处理导致两种菌胞外蛋白浓度随时间及浓度显著升高，至6 h时约为1 mg/mL；胞外AKP活性也呈时间-浓度依赖性上升，12 h时E. coli的MIC₈₀和2MIC₈₀组AKP活性分别约为2.7和3.7 U/50 mL，S. aureus分别为3.0和4.2 U/50 mL。Zeta电位结果显示，两种菌的负电荷表面电位在提取物处理后向负值减小方向移动，表明细菌表面电荷发生改变。这些结果共同表明提取物破坏了细菌细胞包膜的完整性。

3.5 对胞内ATP含量的影响

在MIC₈₀和2MIC₈₀处理后，两种菌的胞内ATP水平均显著下降，且呈浓度依赖性。S. aureus的ATP含量由对照组的约1.18 μmol/10⁶ cells降至0.50和0.19 μmol/10⁶ cells，E. coli则由约0.92 μmol/10⁶ cells降至0.33和0.09 μmol/10⁶ cells。结果提示能量代谢受到干扰。

3.6 对细菌细胞氧化应激的影响

SOD活性在提取物处理初期下降，随后随暴露时间延长而上升，后期各处理组SOD活性显著高于对照，其中2MIC₈₀组最高。MDA含量则呈浓度依赖性升高，E. coli在2MIC₈₀处理4 h时达3.21 nmol/10⁶ cells，为对照组的9.73倍；S. aureus在8 h时达2.18 nmol/10⁶ cells，为对照组的6.81倍。这说明细菌细胞经历了氧化还原状态失衡和脂质过氧化。

3.7 对细菌形态和蛋白谱的影响

SEM观察显示，未经处理的两种菌细胞形态规则、表面光滑；提取物处理后，S. aureus细胞表面粗糙、轻微皱缩、局部塌陷并出现孔隙样缺陷，E. coli则出现明显皱缩、变形、表面不规则、膜破裂和成孔现象。TEM观察进一步显示处理细胞胞内电子密度降低、细胞质溶解、细胞壁或膜结构局部破坏、膜塌陷及质壁分离样变化。SDS-PAGE分析显示，MIC₈₀处理后，两种菌的胞内蛋白条带强度随时间逐渐减弱，与胞外蛋白泄漏增加的测定结果一致。

四、讨论与结论

综合来看，怀菊花多酚提取物的酚类指纹以黄酮为主，木犀草苷和咖啡酸为主要活性成分，多种酚类化合物协同贡献了抗菌效应。提取物通过破坏细胞包膜完整性、增加通透性、引起胞内蛋白和ATP泄漏、改变表面电荷、诱导氧化应激失衡，最终导致细菌形态损伤和细胞死亡。值得注意的是，E. coli的形态破坏较S. aureus更明显，这可能与革兰氏阴性菌存在外膜而肽聚糖层较薄的结构特点有关。SOD和MDA的变化提示氧化还原相关反应参与抗菌过程，但研究未直接测定活性氧（ROS）水平，因此仅描述为氧化还原相关变化，而非ROS生成证据。本研究阐明了怀菊花多酚提取物对食源性致病菌的抗菌机制，为其作为天然抗菌剂在食品保鲜中的应用提供了实验依据。未来需进一步评估其在肉制品、饮料即食食品等真实食品基质中的安全性、储存稳定性和抗菌效力，并考察其对食品感官品质的影响以确定适宜的应用形式和有效浓度。