组蛋白乙酰化调控肠道NHE3基因表达的新型表观遗传机制

《International Journal of Molecular Sciences》：A Novel Epigenetic Mechanism of Intestinal NHE3 Gene Regulation by Histone Acetylation

　　

NHE3是肠道中一种必需的Na⁺转运体，与炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）或肠道感染相关的腹泻有关。然而，组蛋白乙酰化对肠道NHE3基因表达的影响此前尚未被研究。研究人员采用了多种方法，包括人肠道上皮细胞（Caco2细胞）、离体（ex vivo）小鼠和人回肠类器官（enteroids）以及体内（in vivo）小鼠模型，并结合实时qPCR、Western blot、免疫荧光染色、染色质免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation，ChIP）和H3K27Ac HiChIP测序分析等技术。研究结果表明，丙戊酸（valproic acid，VPA，一种I类组蛋白去乙酰化酶抑制剂）显著提高了肠上皮细胞（intestinal epithelial cells，IECs）中NHE3 mRNA和蛋白的水平。ChIP和染色质可及性实验揭示，在VPA处理的Caco2细胞中，NHE3启动子p-1329/p-541区域乙酰化组蛋白（H3/H4）富集增强，且染色质状态更加开放。在Caco2细胞和小鼠/人回肠类器官中，MI192对HDAC2/3的抑制，或通过siRNA在Caco2细胞中敲低HDAC2，均显著增加了NHE3的表达。在Caco2细胞中激活或异位过表达组蛋白乙酰化酶p300，可增加NHE3 mRNA的表达，并增强NHE3启动子p-1329至-161 bp区域内乙酰化组蛋白（H3）的积累。此外，体内实验显示，VPA显著增加了小鼠回肠和近端结肠中NHE3 mRNA的水平，同时NHE3免疫染色增强。对小鼠回肠分离IECs的H3K27Ac HiChIP测序分析表明，VPA增加了H3K27Ac乙酰化，并促进了远端增强子与NHE3启动子之间的染色质成环（chromatin looping），从而刺激NHE3转录。总之，HDAC2抑制和组蛋白乙酰化在上调NHE3表达中发挥关键作用，对与NHE3表达/功能降低相关的炎症性腹泻具有治疗意义。

**研究背景与目的**

NHE3（Na⁺/H⁺交换体3）是肠道中一种必需的Na⁺转运蛋白，定位于肠上皮细胞（intestinal epithelial cells，IECs）顶膜，是介导肠道Na⁺吸收的主要亚型。NHE3表达和/或功能紊乱可导致腹泻及酸碱失衡，其基因突变与先天性钠泻（congenital sodium diarrhea，CSD）相关，且NHE3下调参与炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）相关腹泻的发生。以往研究已表明NHE3受翻译后修饰（如蛋白激酶磷酸化）、转录因子（Sp1/Sp3）、microRNA及DNA甲基化等表观遗传因素调控。尽管丁酸盐作为组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）抑制剂可通过丝氨酸/苏氨酸磷酸酶PP1/PP2A介导的Sp1/Sp3去磷酸化增强人NHE3启动子活性，但组蛋白乙酰化对肠道NHE3基因表达的直接影响此前尚未被探讨。鉴于HDAC抑制剂在IBD和结肠炎相关疾病中显示出治疗潜力，研究人员开展了本研究，旨在阐明组蛋白乙酰化调控肠道NHE3基因表达的分子机制。

**研究内容与意义**

研究人员利用人肠上皮Caco2细胞（ATCC，HTB-37）、离体小鼠和人回肠类器官及体内小鼠模型，结合实时qPCR、Western blot、免疫荧光染色、ChIP、染色质可及性实验和H3K27Ac HiChIP测序等技术，揭示了组蛋白乙酰化/HDAC2抑制通过增强NHE3启动子区域组蛋白H3/H4乙酰化、促进染色质开放及增强子-启动子染色质成环而上调NHE3表达的新型表观遗传机制。该研究论文发表在《International Journal of Molecular Sciences》。这一发现为IBD相关腹泻等NHE3表达/功能下降的肠道疾病提供了新的治疗靶点和策略。

**主要技术方法**

研究采用的主要方法包括：（1）人肠上皮Caco2细胞培养及VPA、MI192、CTPB等药物处理；（2）小鼠（C57BL/6J，Jackson Laboratory）和人回肠隐窝来源类器官培养；（3）体内小鼠模型（VPA 150或400 mg/kg体重腹腔注射，每日一次，共3天）；（4）实时qPCR和Western blot检测NHE3 mRNA及蛋白表达；（5）染色质免疫沉淀（ChIP）检测乙酰化组蛋白H3（K9/K14）和H4（K12）与NHE3启动子（p-1509/+127）各区域的结合；（6）染色质可及性实验评估启动子区域染色质开放状态；（7）H3K27Ac HiChIP测序分析（对照3只小鼠混合为1个样本，VPA组4只小鼠混合为1个样本）；（8）HDAC2特异性siRNA敲低实验。

**研究结果**

**2.1 丙戊酸抑制HDAC导致Caco2细胞NHE3基因表达增加**

VPA（1–2 mM）处理24或48小时使Caco2细胞NHE3 mRNA表达显著增加约2–3倍，VPA（2 mM，24 h）亦显著增加NHE3蛋白水平。VPA与广谱HDAC抑制剂曲古抑菌素A（trichostatin A，TSA）联合处理未产生额外的协同效应，提示二者通过相似机制刺激NHE3 mRNA表达。

**2.2 丙戊酸改变NHE3基因启动子组蛋白状态**

ChIP实验显示，VPA处理使NHE3启动子p-1128至-948 bp区域乙酰化组蛋白H3和H4分别增加12倍和18倍，p-1329至-541 bp多个区域H3/H4乙酰化亦显著增强（5–11倍），而p-406至+118 bp区域仅见H3约3倍增加、H4几乎无变化。染色质可及性实验表明p-1329至-541 bp区域由部分开放状态转变为开放状态，而p-406至+118 bp区域维持部分开放。

**2.3 HDAC2抑制导致NHE3表达增加**

HDAC2/3特异性抑制剂MI192（1–2 μM）处理Caco2细胞使NHE3 mRNA显著增加约6–8倍；MI192（2或5 μM）亦使小鼠回肠类器官NHE3 mRNA增加约3倍，并升高人回肠类器官NHE3蛋白水平；HDAC2特异性siRNA敲低（100 nM，72 h）使Caco2细胞NHE3 mRNA增加约50%，证实HDAC2是介导VPA效应的关键亚型。

**2.4 组蛋白乙酰化酶p300增强NHE3表达**

p300激活剂CTPB（10 μM，24 h）处理使Caco2细胞NHE3 mRNA增加约2倍；p300表达载体过表达使NHE3 mRNA增加约2.5倍。ChIP实验显示p300过表达增强NHE3启动子p-1329至-161 bp区域乙酰化组蛋白H3的积累，但对p-125至+118 bp区域无影响。

**2.5 丙戊酸增加小鼠肠道NHE3表达**

VPA（150或400 mg/kg）腹腔注射3天使小鼠回肠和结肠NHE3 mRNA显著增加约2.5倍，而NHE2 mRNA无变化，表明VPA效应具有NHE3特异性；免疫荧光染色证实VPA处理小鼠近端结肠NHE3蛋白水平升高。

**2.6 VPA应答下NHE3基因座调控元件（增强子）分析**

对小鼠回肠分离IECs的H3K27Ac HiChIP测序显示，VPA处理使NHE3（slc9a3）基因座约74,100至74,140 kb区域H3K27Ac乙酰化标记显著富集，并增加了远端增强子与NHE3启动子之间的染色质接触弧（chromatin loops），提示VPA通过促进增强子-启动子三维染色质成环激活NHE3转录。

**讨论与结论**

讨论部分指出，NHE3启动子p-406至+118 bp区域含CpG岛（-353/+70 bp），该区域在VPA作用下仅观察到有限的组蛋白乙酰化增加且染色质维持部分开放状态，提示DNA甲基化可能通过甲基CpG结合蛋白（methyl CpG-binding protein，MBD）招募HDAC相关共抑制复合物影响该区域染色质结构，单独VPA处理不足以逆转此区域的异染色质状态。研究还指出，HDAC抑制剂（如SAHA、VPA）可通过减轻DSS/TNBS诱导结肠炎的炎症、改善肠道屏障功能而缓解IBD，但泛HDAC抑制剂存在血小板减少、疲劳和腹泻等副作用，而特异性HDAC2抑制可能减少脱靶效应并更具临床优势。研究结论为：HDAC2抑制和组蛋白乙酰化通过增加NHE3启动子区域H3/H4乙酰化、促进染色质开放及增强子-启动子染色质成环等表观遗传机制上调肠道NHE3表达，这些NHE3上调的新型机制为IBD相关腹泻等NHE3表达/功能下调的肠道疾病奠定了创新性治疗策略的基础。