《International Journal of Molecular Sciences》：Expression and Immunogenic Application of Recombinant DENV-2 rprM Protein for the Non-Invasive Detection of Salivary IgA Antibodies
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登革热病毒（DENV）血清型1–4可致登革热，这是一种在热带和亚热带地区再度流行的重大传染病。本研究评估了重组DENV-2前膜蛋白（rprM-DENV-2）的抗原性及其检测抗DENV人IgA抗体的能力。研究人员在大肠杆菌（Escherichia coli）中表
登革热病毒（DENV）血清型1–4可致登革热，这是一种在热带和亚热带地区再度流行的重大传染病。本研究评估了重组DENV-2前膜蛋白（rprM-DENV-2）的抗原性及其检测抗DENV人IgA抗体的能力。研究人员在大肠杆菌（Escherichia coli）中表达rprM-DENV-2蛋白，经纯化后评估其免疫原性与抗原性。该重组蛋白可在大鼠体内诱导IgG抗体，该抗体能够检测Vero细胞中的DENV感染。重要的是，在确诊登革热患者的配对唾液和血清样本中，利用rprM-DENV-2抗原通过ELISA可检测到IgA抗体，而阴性对照组（居住在非流行区的受试者）样本中未检出该抗体，差异具有显著统计学意义（p < 0.0001）。上述发现表明，rprM-DENV-2保留了与天然病毒蛋白相似的抗原特性；该蛋白可能适用于DENV感染的体外研究及非侵入性临床样本中IgA的检测。
**研究背景、问题与研究目的**
登革热是由登革热病毒（DENV）血清型1–4引起的蚊媒病毒性疾病，在热带和亚热带地区持续构成重大公共卫生威胁。准确的病原学诊断对登革热的临床管理至关重要，尤其在发热期向危重期转化阶段，预警征象的出现提示血浆渗漏和出血风险增加。目前登革热的实验室诊断主要依赖病毒分离、病毒基因组或NS1抗原的分子检测，以及血清中病毒特异性IgM抗体的血清学检测，但这些方法在检测时机、侵入性采血和交叉反应等方面均存在局限。DENV颗粒表面的prM蛋白在病毒感染过程中可广泛暴露于宿主免疫系统，能诱导强烈且保守的抗体应答，成为具有潜力的血清学检测靶抗原。此外，唾液中分泌型IgA抗体的检测提供了非侵入性诊断的可行途径。基于上述背景，该研究旨在利用原核表达系统制备重组DENV-2 prM蛋白（rprM-DENV-2），评估其免疫原性与抗原性，并探索以该蛋白为抗原检测登革热患者唾液及血清中抗DENV IgA抗体的可行性，为开发非侵入性诊断工具提供概念验证（proof-of-principle）。该论文发表在《International Journal of Molecular Sciences》。
**关键技术与方法**
研究人员将DENV-2 prM蛋白第6–166位氨基酸编码序列（GenBank登录号CAA51363.1）克隆至pPROEX HTa载体，转化大肠杆菌（Escherichia coli）BL21 STAR (DE3)，经IPTG诱导表达，采用Ni-NTA亲和层析纯化获得rprM-DENV-2蛋白。以该蛋白免疫Wistar大鼠制备多克隆抗血清，通过间接ELISA和免疫荧光染色评估其免疫原性及其对Vero细胞中天然病毒抗原的识别能力。临床样本方面，纳入2014年6–8月墨西哥韦拉克鲁斯州登革热暴发期间20例确诊患者的配对唾液与血清样本（按有无警示征象各10例）及18例墨西哥城非流行区阴性对照受试者样本，以rprM-DENV-2为包被抗原建立间接ELISA检测抗prM IgA抗体，并采用ROC曲线评估诊断效能。
**研究结果**
**2.1 重组质粒的构建**
研究人员从DENV-2感染的C6/36细胞cDNA中经PCR扩增获得编码prM蛋白第6–166位氨基酸的498 bp基因片段，将其克隆至pPROEX HTa原核表达载体，通过限制性酶切分析和DNA测序验证了插入片段的正确性与方向。
**2.2 rprM-DENV-2蛋白的表达与鉴定**
经IPTG诱导后，SDS-PAGE和Western blot分析显示该蛋白在诱导后3小时即可表达，分子量约为21 kDa，与理论预测大小一致。采用Ni-NTA亲和层析纯化获得高纯度rprM-DENV-2蛋白，平均产量为8 mg/mL。Dot blot实验证实该蛋白可被抗prM-DENV单克隆抗体识别，表明其保留了与天然病毒蛋白相似的构象表位。
**2.3 抗原特性的间接评估**
**2.3.1 大鼠高免血清的制备**
以rprM-DENV-2蛋白免疫Wistar大鼠后，通过间接ELISA检测到特异性IgG抗体应答，高免血清在1:400稀释度下仍显示显著高于免疫前血清的反应水平（p < 0.01），表明该重组蛋白具有良好的免疫原性。
**2.3.2 抗血清用于DENV感染的体外检测**
以DENV-2（MOI=2）感染Vero细胞后，以大鼠高免血清进行免疫荧光染色，结果显示高免血清能够特异性识别感染细胞中表达的天然prM蛋白，而免疫前血清无阳性信号，间接证实重组蛋白的抗原特性与天然蛋白高度相似。
**2.4 rprM-DENV-2蛋白的抗原性及其在ELISA中的应用**
以rprM-DENV-2为包被抗原的间接ELISA检测显示，登革热确诊患者唾液和血清样本中的抗prM IgA抗体水平均显著高于阴性对照组（p < 0.0001）。配对样本Wilcoxon符号秩检验显示，血清IgA水平（中位数853 EU/mL）显著高于唾液（中位数225 EU/mL）。ROC曲线分析显示，唾液样本的曲线下面积（AUROC）为88.3%，cut-off值为103.6 EU/mL时灵敏度为80%、特异度为100%，阳性预测值（PPV）和阴性预测值（NPV）分别为100%和81.8%；血清样本的AUROC为100%，灵敏度与特异度均为100%，PPV和NPV均为100%。按临床分组进一步分析发现，无论是有警示征象（WS）还是无警示征象（No WS）的登革热患者，其唾液和血清中的抗prM IgA水平均无显著差异。
**讨论与结论**
讨论部分指出，prM蛋白在四种DENV血清型中比E蛋白更为保守，适用于广泛的血清学筛查。原核系统非糖基化表达的rprM-DENV-2蛋白仍具备良好的免疫原性和抗原性，这与prM蛋白仅需少量糖基化即可维持结构和功能有关，计算机表位分析也表明其B细胞表位不依赖糖基化。唾液中IgA抗体的检出为无法耐受采血或地处偏远地区的患者提供了非侵入性监测手段。研究同时指出，样本量较小是本研究的局限之一，且prM蛋白在DENV血清型间存在较强的交叉反应性，可能影响病毒血清型的特异鉴定，未来需要在更大样本
