《International Journal of Molecular Sciences》：Low-Molecular-Weight Salmon Collagen Peptides Promote Extracellular Matrix Gene (ECM) Expression in BJ Fibroblasts
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鲑鱼皮作为海产品加工中产生的大量副产品，为循环生物经济提供了可持续的高附加值成分途径。本研究旨在利用分步酶解工艺从鲑鱼皮中制备低分子量胶原肽（LMWCPs），并在人BJ成纤维细胞中评估其安全性和促细胞外基质（ECM）活性。通过顺序水解（先用碱性蛋白酶/木瓜蛋白
鲑鱼皮作为海产品加工中产生的大量副产品，为循环生物经济提供了可持续的高附加值成分途径。本研究旨在利用分步酶解工艺从鲑鱼皮中制备低分子量胶原肽（LMWCPs），并在人BJ成纤维细胞中评估其安全性和促细胞外基质（ECM）活性。通过顺序水解（先用碱性蛋白酶/木瓜蛋白酶，再用胶原酶）制备LMWCPs，并将其表征为平均分散粒径约为117 nm的低分子量肽制剂。LMWCPs显示带负电荷的肽分散体，其质量中心约在~1 kDa。细胞相容性（MTT）检测显示在高达1.5 mg/mL浓度下处理48 h无毒性。通过逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）进行的基因表达分析揭示了一种稳健的剂量依赖性ECM应答：I型胶原α1链（COL1A1）增加约7倍，同时多能蛋白聚糖（VCAN）水平额外升高5–6倍，弹性蛋白（ELN）和转化生长因子-β（TGF-β）也有适度增加。这些发现为两步水解工艺、所得LMWCPs的理化特性以及BJ成纤维细胞中ECM相关基因表达变化之间建立了一个探索性的过程-表型关联。总体而言，本研究表明鲑鱼皮LMWCPs在测试浓度范围内具有细胞相容性，并调节了多个ECM相关基因，为未来的蛋白质水平、功能和转化评估提供了初步基础。
论文解读：低分子量鲑鱼皮胶原蛋白肽对成纤维细胞外基质基因表达的促进作用
一、研究背景与目的
皮肤的生物力学特性源于细胞、细胞因子和生长因子在细胞外基质（ECM）支架内的相互作用。其中，I型胶原蛋白是皮肤中最主要的胶原类型，约占皮肤胶原总量的90%，负责维持皮肤的结构组织和抗拉强度。真皮层中的成纤维细胞在转化生长因子-β（TGF-β）刺激下，能够合成I型胶原、弹性蛋白和蛋白聚糖，从而调控ECM的表达、沉积与更新。然而，随着年龄增长及外界因素如紫外线照射、污染等影响，ECM会发生退化，表现为胶原纤维断裂和减少、弹性蛋白降解增加等，最终导致皮肤结构改变和衰老相关特征的出现。
以往大多数研究仅关注单一指标如胶原或弹性蛋白的变化，而忽略了多能蛋白聚糖（VCAN）和上游TGF-β信号轴在真皮基质组装、水合作用和重塑中的重要作用。因此，寻找能够有效调节真皮成纤维细胞中ECM相关反应的海洋源胶原水解物成为研究热点。鲑鱼皮作为鱼类加工的副产物，来源丰富且成本低廉，可被转化为高附加值的化妆品活性成分，符合循环生物经济理念。本研究旨在通过分步酶解法制备低分子量胶原肽（LMWCPs），评估其在BJ成纤维细胞中的安全性以及对关键ECM相关基因mRNA表达的影响，并探讨制备工艺、理化特性与转录响应之间的关联。
二、主要技术方法
研究人员采用以下关键技术方法开展研究：
- 1.
分步酶解工艺：首先使用碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶混合酶进行第一步水解，随后加入不同浓度的胶原酶进行第二步水解，以获得低分子量胶原肽。
- 2.
理化性质表征：通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）测定分子量分布，使用液体颗粒粒度分析仪测量平均粒径和zeta电位，扫描电子显微镜观察粉末形态，并分析氨基酸组成。
- 3.
细胞毒性评价：采用MTT法评估LMWCPs对人BJ成纤维细胞（来源于新生儿包皮的正常人类皮肤成纤维细胞，ATCC CRL-2522）在24小时和48小时处理后的细胞活力。
- 4.
基因表达分析：通过逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测经不同浓度LMWCPs处理后BJ细胞中COL1A1、COL3A1、ELN、VCAN和TGF-β的mRNA相对表达水平，以GAPDH作为内参基因。
三、研究结果
3.1 水解度
第一步水解（碱性蛋白酶/木瓜蛋白酶混合物）在最初30分钟内使水解度快速升至约22%，随后在60-120分钟进入平台期，表明易接近的切割位点暂时耗尽。第二步加入胶原酶后，水解度显著增加，尤其是在较高胶原酶浓度下。当使用4%胶原酶、总水解时间为240分钟时，获得最高水解度36.93%。这表明两步酶解工艺能够有效克服单步水解的平台限制，生成更低分子量的肽段。
3.2 LMWCPs的特性
喷雾干燥的LMWCP粉末含36.17%蛋白质、0.11%脂肪、3.35%水分、1.02%灰分和59.36%碳水化合物。氨基酸组成分析显示甘氨酸含量最高（339残基/1000残基），脯氨酸和羟脯氨酸分别为107和55残基/1000残基，这与母体胶原的特征序列一致。MALDI-TOF结果显示肽段分子量主要集中在900-2000 Da之间，优势肽段约在1072 Da。平均粒径为117 nm，zeta电位为-37.12 mV，表明具有良好的分散稳定性和静电稳定性。SEM图像显示粉末主要为球形颗粒，部分存在凹陷或塌陷，这是喷雾干燥产品的典型特征。
3.3 LMWCPs的细胞毒性
MTT检测结果显示，在24小时处理下，所有测试浓度（0.325-3.0 mg/mL）的细胞活力均与未处理对照组相当（约97-102%）。在48小时处理下，0.325-1.5 mg/mL浓度范围内细胞活力仍保持良好，但在3.0 mg/mL浓度下细胞活力下降至约82-85%。因此，研究人员确定≤1.5 mg/mL为安全有效的浓度范围，用于后续ECM相关基因表达分析。
3.4 基因表达分析
RT-qPCR分析显示，LMWCPs以浓度依赖性方式显著刺激BJ成纤维细胞中ECM相关基因的表达。COL1A1表现出最显著的上调，在1.0 mg/mL和0.5 mg/mL浓度下分别实现约7.0倍和6.6倍的增加。COL3A1仅在最高浓度下出现约2倍的适度增加。VCAN表达也大幅上调，在1.0、0.5和0.25 mg/mL浓度下分别达到5.7、4.8和4.5倍。ELN和TGF-β在所有测试浓度下均呈现约1.2-2.0倍的适度增加，且在高浓度下变化幅度相对较小。这些结果表明COL1A1和VCAN显示出最强的转录响应，而ELN和TGF-β则提供支持性诱导作用。
四、讨论与结论
研究人员指出，COL1A1的强效剂量依赖性上调与TGF-β介导的成纤维细胞激活机制一致，TGF-β可通过Smad通路促进胶原合成。虽然ELN mRNA的增加幅度较为温和，但即使是小幅度的弹性蛋白合成增加对于维持皮肤弹性和韧性也具有重要意义。VCAN表达增加则提示蛋白聚糖合成增强，有助于调节ECM组织、细胞黏附和组织水合作用。
本研究创新性地将两步水解工艺条件与MALDI定义的低分子量谱、分散特性以及ECM相关mRNA表达变化联系起来，建立了从工艺到转录响应的初步框架。但研究也存在局限性，包括仅使用单个水解批次、依赖短期体外暴露和基因水平的终点指标。未来研究应验证蛋白质水平效应、扩展至离体人体皮肤模型并进行初步临床评估。
研究结论翻译：本研究为鲑鱼皮LMWCPs建立了一个过程-表型框架，并展示了在非细胞毒性条件下伴随强烈胶原和多能蛋白聚糖响应的扩增细胞外基质基因特征。这些发现指出了在简单外用基质中进行下一步研究的实践方向，需关注颗粒特性和zeta电位的稳定性，并将基因表达桥接到支撑产品宣称的蛋白质结果。此外，工业可扩展性仍是关键里程碑，包括多批次生产、明确放行标准、原料变异性控制以及与常规干燥和包装流程的兼容性。在本研究中，重要局限性包括使用单一水解批次、依赖短期体外暴露和基因水平终点。未来工作应验证蛋白质水平效应，扩展到离体人体皮肤，并进行先导临床评估。除了再现已知的ECM刺激外，本研究还定义了一种制备方法及其伴随的扩展且机制关联的ECM特征。这些发现为鲑鱼皮LMWCPs的未来转化评估提供了初步基础，而非转化或化妆品应用准备就绪的证据。这种对鱼类加工副产物的增值化利用符合循环生物经济目标以及化妆品行业对可持续、非哺乳动物和可追溯活性成分日益增长的需求。在潜在皮肤健康应用得以确立之前，仍需进一步验证蛋白质水平效应、生物学功能、安全性、制造重现性以及在更具生理相关性模型中的表现。
